补肾中药通过调控Notch1蛋白的表达治疗大鼠骨质疏松性骨折的作用研究

目的探究补肾中药对大鼠骨质疏松骨折的治疗作用和机制。方法选取老年雌性大鼠60只,分为正常组、骨质疏松骨折模型组、高、中、低剂量补肾中药治疗组,各组均摘除卵巢,术后3个月形成骨质疏松模型。随后除正常组外,其余各组均建立股骨骨折模型。骨质疏松骨折模型建立后,每日给予正常组与模型组生理盐水进行灌胃,治疗组分别给予高、中、低剂量补肾中药灌胃12 w进行治疗。末次实验结束后麻醉大鼠,应用双能X射线检测大鼠股骨的骨密度。采取血清样品通过ELISA法测量碱性磷酸酶、骨钙素、TRAP破骨标志物等指标含量,对股骨样品进行病理学检查以及Western blot法检测Notch1蛋白的表达。结果病理组织学切片结果显示,高剂量治疗组在骨折端的成骨细胞数量较多,破骨细胞数量较少,提示补肾中药具有促进骨性愈合的效果。经补肾中药治疗后,高剂量治疗组的骨密度与模型组相比骨密度显著回升。研究发现,strACP经过补肾中药治疗后,治疗组中的碱性磷酸酶与血清抗酒石酸性磷酸酶的含量显著降低,骨钙素含量明显提升,上述指标在高剂量治疗组中与模型组相比差异均具有统计学意义(P<0.01),呈明显的剂量依赖性。另外,Western blot法检测结果也显示,Notch1蛋白的表达在模型组中受到显著抑制(与正常组相比,P<0.01),而补肾中药具有调节Notch1蛋白表达的作用,成明显剂量相关性,且高剂量治疗组的表达水平与正常组接近。结论补肾中药能够通过调节Notch1蛋白的表达来抑制血清中破骨标志物碱性磷酸酶和TRAP的水平,并提高骨钙素的含量来刺激成骨细胞生成、抑制破骨细胞分化,从而加速骨折的愈合,提高骨密度,对大鼠股骨骨质疏松骨折具有良好的治疗作用。

不同月龄BALB/c小鼠耳蜗miR-96表达与ABR阈值及耳蜗形态的关系

目的研究不同月龄BALB/c小鼠ABR阈值、耳蜗形态学改变及miR-96的表达,明确miR-96对老年性聋小鼠听力的调节作用。方法通过听性脑干反应测试、荧光染色、扫描电镜,观察3、6、12、18月龄BALB/c小鼠8 kHz听反应阈值及耳蜗形态学改变。实时定量PCR定量检测miR-96在各月龄BALB/c小鼠耳蜗内的表达。SPSS13.0统计软件进行统计分析。结果 3、6、12月龄组小鼠8 kHz听反应阈值分别为(18.5±8.3)、(45.8±7.8)、(85.6±15.6)dB SPL,18月龄组120 dB SPL刺激声基本测不出听觉反应。荧光染色及扫描电镜发现,自6月龄起毛细胞出现显著缺失,静纤毛出现不同程度缺失、倒伏、融合、变短和转位等改变,并随月龄增大病变逐渐加重。miR-96在3、6、12、18月龄BALB/c小鼠耳蜗中的相对表达量(2^(-△CT))分别为0.0225±0.0073、0.0162±0.0048、0.0116±0.0048和0.0050±0.0014,与3月龄小鼠相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BALB/c小鼠听力损失、耳蜗毛细胞缺失及纤毛损害随月龄增长而逐渐加重,小鼠耳蜗中miR-96表达随月龄增加而减少,提示miR-96可能在老年性聋的发病机制中起重要用。

敏咳汤对实验性哮喘豚鼠炎性细胞、炎性介质和细胞因子影响实验研究

目的:探索敏咳汤对支气管哮喘豚鼠中炎性细胞(ECP)、炎性介质(NO)和细胞因子的影响。方法:选择清洁级封闭群幼龄雄性豚鼠50只,将其分为5组(哮喘模型组、中药大剂量组、中药小剂量组、地塞米松片对照组、正常对照组),采用卵白蛋白造模法。观察敏咳汤对哮喘豚鼠血清中炎性细胞(ECP)、炎性介质(IL-2、IL-3、IL-4、IL-13)和NO含量的影响。结果:敏咳汤可有降低血清中NO、ECP、IL-3、IL-13的含量、降低支气管肺泡灌洗液中IL-4的含量;提高血清IL-2的含量。结论:通过上述实验,可知敏咳汤从哮喘发病多个环节阻滞哮喘的发生。(1)敏咳汤可缩短哮喘发生症状的持续时间。(2)敏咳汤可升高IL-2的含量,恢复Th1/Th2类细胞因子免疫应答失衡,从而减少哮喘的发生。(3)敏咳汤可降低IL-4和IL-13的含量,减少IgE合成的细胞因子,阻滞哮喘的发生。(4)敏咳汤减少IL-3的含量,在支气管哮喘发病中,一则阻滞嗜碱、肥大细胞增殖和活性,二则减少嗜酸细胞活性。(5)敏咳汤可降低NO的含量,减少气道的炎症。这种机制在于NO能阻断嗜酸性粒细胞凋亡,从而间接加重或促进嗜酸性粒细胞炎症反应。同时作为信使的NO可抑制TH1细胞,促进TH2细胞的激活,致使激活炎性细胞的细胞因子IL-4生成过多,加重气道炎症反应。(6)敏咳汤可降低ECP的含量,减少哮喘季节性的发作,如花粉的诱发,减少气道的炎症反应。

偏侧咀嚼对大鼠髁突软骨中骨形成蛋白2表达的影响

目的:探讨偏侧咀嚼对大鼠髁突软骨内骨形成蛋白2(BMP2)表达的影响及其意义。方法:雌性大鼠24只,随机平均分为2个实验组和2个对照组,每组6只。实验组中大鼠分别在建立偏侧咀嚼模型后4、8周处死,对照组中大鼠同期处死。免疫组化SABC法检测对照组和实验组大鼠髁突软骨中BMP2的表达变化,并作图像分析和统计学处理。结果:实验4和8周时,实验组中大鼠咀嚼侧髁突软骨中BMP2的表达均高于对照组和非咀嚼侧(P<0.05)。其中在实验8周时,实验组中大鼠非咀嚼侧髁突软骨中BMP2的表达较对照组稍低(P<0.05)。结论:BMP2参与了偏侧咀嚼致颞下颌关节髁突软骨的改建活动。

淫羊藿苷干预大鼠椎间盘源性腰痛的实验研究

目的:探讨淫羊藿苷(icariin,ICA)干预大鼠椎间盘源性腰痛的效果及可能的作用机制。方法:将45只8周龄SPF级雄性SD大鼠随机分为5组,假手术组、生理盐水组、ICA 50 mg·kg^-1组、ICA 100 mg·kg^-1组各10只,塞来昔布组5只。生理盐水组、ICA 50 mg·kg^-1组、ICA 100 mg·kg^-1及塞来昔布组大鼠通过L_(4~5)和L_(5~6)椎间盘穿刺建立大鼠腰痛模型;假手术组仅显露椎间盘,不进行穿刺。自造模后第7天开始进行药物干预,至造模后第21天结束。ICA 50 mg·kg^-1组和ICA 100 mg·kg^-1组以ICA溶液进行灌胃(ICA溶于去离子水中),每天剂量分别为50 mg·kg^-1和100 mg·kg^-1;塞来昔布组以塞来昔布胶囊进行灌胃(塞来昔布胶囊粉剂溶于去离子水中),每天100 mg·kg^-1;生理盐水组以生理盐水灌胃,每天100 mg·kg^-1;假手术组常规饲养,不进行干预。从各组随机选取5只大鼠,分别于造模前、造模后第7天、第14天、第21天、第28天、第35天进行足底机械性疼痛阈值检测。造模后第35天,足底疼痛阈值测定结束后处死假手术组、生理盐水组、ICA 50 mg·kg^-1组和ICA 100 mg·kg^-1组的5只大鼠,以qRT-PCR法测定椎间盘组织中P物质(substance P,SP)mRNA和降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)mRNA的含量。造模后第21天时,处死假手术组、生理盐水组、ICA 50 mg·kg^-1组和ICA 100 mg·kg^-1组其余的5只大鼠,以ELISA法测定大鼠椎间盘组织中细胞因子诱导的中性粒细胞趋化剂-1(cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1,CINC-1)含量。结果:①足底机械性疼痛阈值。时间因素和分组因素存在交互效应(F=17.971,P=0.001)。5组大鼠的足底机械性疼痛阈值总体比较,差异有统计学意义,即存在分组效应(F=146.660,P=0.000)。造模前后不同时点间足底机械性疼痛阈值的差异有统计学意义,即存在时间效应(F=118.057,P=0.000)。假手术组足底机械性疼痛阈值随时间未见明显变化,一直处于较高水平[(14.60±0.89)g,(14.79±0.47)g,(15.00±0.00)g,(15.00±0.00)g,(15.00±0.00)g,(15.00±0.00)g,F=0.836,P=0.537]。生理盐水组足底机械性疼痛阈值造模后明显降低,后期一直维持在较低水平[(14.67±0.74)g,(3.44±2.22)g,(3.19±1.37)g,(2.84±0.96)g,(3.92±1.36)g,(3.02±0.98)g,F=58.882,P=0.000]。ICA 50 mg·kg^-1组、ICA 100 mg·kg^-1组和塞来昔布组造模前后的足底机械性疼痛阈值变化趋势基本一致,造模后均先降低,药物干预开始后逐渐回升,药物干预结束后又逐渐降低[(15.00±0.00)g,(2.78±0.81)g,(4.64±1.67)g,(5.59±1.25)g,(8.52±1.63)g,(6.11±1.49)g,F=56.088,P=0.000;(14.66±0.76)g,(2.53±1.37)g,(10.65±2.69)g,(9.67±2.41)g,(10.67±2.04)g,(8.59±2.95)g,F=16.684,P=0.000;(15.00±0.00)g,(2.28±1.03)g,(12.09±1.28)g,(12.37±1.34)g,(6.71±2.89)g,(5.18±1.88)g,F=44.668,P=0.000]。造模后第7天时,ICA 50 mg·kg^-1组、ICA 100 mg·kg^-1组和塞来昔布组的足底机械性疼痛阈值两两比较,组间差异均无统计学意义。造模后第14天时,ICA 100 mg·kg^-1组和塞来昔布组的足底机械性疼痛阈值均高于ICA 50 mg·kg^-1组(P=0.001;P=0.000);ICA 100 mg·kg^-1组和塞来昔布组的足底机械性疼痛阈值比较,差异无统计学意义。造模后第21天时,ICA 100 mg·kg^-1组和塞来昔布组的足底机械性疼痛阈值均高于ICA 50 mg·kg^-1组(P=0.009;P=0.000);ICA 100 mg·kg^-1组和塞来昔布组的足底机械性疼痛阈值比较,差异无统计学意义。造模后第28天时,ICA 100 mg·kg^-1组的足底机械性疼痛阈值高于塞来昔布组(P=0.049);ICA 50 mg·kg^-1组与ICA 100 mg·kg^-1组、塞来昔布组比较,组间差异均无统计学意义。造模后第35天时,ICA 50 mg·kg^-1组、ICA 100 mg·kg^-1组和塞来昔布组的足底机械性疼痛阈值两两比较,组间差异均无统计学意义。②椎间盘组织CINC-1含量。造模后第21天,假手术组、生理盐水组、ICA 50 mg·kg^-1组及ICA 100 mg·kg^-1组大鼠椎间盘组织中CINC-1含量比较,差异有统计学意义[(534.2±142.6)pg·mL^(-1),(28 376.0±976.7)pg·mL^(-1),(21 866.0±1 536.0)pg·mL^(-1),(9 956.0±1 010.0)pg·mL^(-1),F=423.000,P=0.000]。生理盐水组的CINC-1含量高于假手术组、ICA 50 mg·kg^-1组和ICA 100 mg·kg^-1组(P=0.000;P=0.003;P=0.000);ICA 50 mg·kg^-1组的CINC-1含量高于ICA 100 mg·kg^-1组(P=0.000)。③椎间盘组织SP mRNA和CGRP mRNA含量。造模后第35天,假手术组、生理盐水组、ICA 50 mg·kg^-1组及ICA 100 mg·kg^-1组大鼠椎间盘组织中SP mRNA和CGRP mRNA含量比较,组间差异均有统计学意义(1.04±0.49,183.50±118.60,55.50±10.26,19.53±8.05,F=9.499,P=0.000;0.74±0.21,6.29±2.06,1.55±0.69,1.19±0.37,F=27.180,P=0.000)。生理盐水组的SP mRNA含量高于假手术组、ICA 50 mg·kg^-1组和ICA 100 mg·kg^-1组(P=0.008;P=0.042;P=0.015);ICA 50 mg·kg^-1组的SP m RNA含量高于ICA 100 mg·kg^-1组(P=0.000)。生理盐水组的CGRP m RNA含量高于假手术组、ICA 50 mg·kg^-1组和ICA 100 mg·kg^-1组(P=0. 000;P=0. 001;P=0. 000);ICA 50mg·kg^-1组和ICA 100 mg·kg^-1组的CGRP m RNA含量比较,差异无统计学意义。结论:ICA可有效缓解大鼠椎间盘源性腰痛,其镇痛效果与剂量有关,与同剂量的塞来昔布相比其镇痛效果持续时间更长,降低大鼠椎间盘组织中CINC-1的水平可能是其镇痛的作用机制之一。

康莱特联合吉非替尼对Lewis肺癌小鼠血管生成的影响

目的 :观察康莱特联合吉非替尼对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及血管生成的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法 :建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型,随机分为4个组:对照组、康莱特单药组、吉非替尼单药组以及康莱特联合吉非替尼治疗组;观察和比较各治疗组肿瘤的生长情况;免疫组织化学法检测移植瘤中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管内皮生长因子受体-2/激酶插入结构域受体(VEGF receptor-2/kinase-insert domain-containing receptor,VEGFR-2/KDR)蛋白的表达情况及微血管密度(microvessel density,MVD)的情况;RT-PCR法检测VEGF和KDR mRNA的表达情况。结果 :康莱特联合吉非替尼治疗组的平均肿瘤质量明显低于康莱特和吉非替尼单药组,差异有统计学意义(P<0.01)。抑瘤率统计结果显示,与对照组相比,康莱特单药组、吉非替尼单药组和康莱特联合吉非替尼治疗组对小鼠移植瘤均有抑制作用,尤以两药联合组更为明显。免疫组织化学检测结果显示,对照组、康莱特单药组、吉非替尼单药组以及康莱特联合吉非替尼治疗组MVD阳性标记指数平均值分别为24.35±1.06、18.25±1.36、20.09±1.46和14.46±0.98,联合用药组的MVD明显低于两个单药组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,2个单药组及联合用药组中VEGF和KDR蛋白的表达水平均明显下调(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,两药联合治疗组的VEGF和KDR mRNA表达水平低于各单药组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 :康莱特联合吉非替尼治疗可能具有协同抗肿瘤血管生成的作用,从而为肺癌的抗肿瘤治疗提供一个新的方法。

纳米金光热作用对ICR小鼠皮肤光老化保护作用的初步研究

目的探讨纳米金光热作用对雌性ICR小鼠皮肤光老化的保护作用及其可能机制。方法32只健康雌性ICR小鼠随机分成正常组、模型组、红光组、纳米金组，每组8只。正常组小鼠不予任何干预，另3组每次照射前背部脱毛，面积约16cm^2。每次照射紫外线前，模型组暂不予以特殊处理。红光组小鼠给予红光照射，纳米金组小鼠先涂抹纳米金球溶液，用黑色塑料薄膜封包30min后再照射红光。经上述处理后，将模型组、红光组、纳米金组小鼠分笼放入灯箱中进行紫外线照射。实验结束后，肉眼及皮肤镜观察皮肤外观变化；取小鼠背部皮肤，组织切片HE染色和Masson染色观察皮肤组织结构和胶原纤维的改变。ImageJ图像分析软件计算胶原纤维面积。DCFH—DA探针检测皮肤细胞内活性氧簇（ROS）含量。ELISA检测皮肤组织中基质金属蛋白酶13（MMP-13）的含量。采用单因素方差分析进行组间差异分析，并用LSD—t检验进行两两多重比较。用简单线性回归分析ROS变化与MMP-13表达量之间的相关性。结果与正常组比较，紫外线照射后，模型组小鼠皮肤出现皮屑、褐黄、粗糙肥厚、深皱纹、缺乏弹性等光老化特征；皮肤镜下小鼠皮肤粗糙，毛细血管断裂出血，结痂，褐色斑点。组织切片显示，模型组小鼠表皮厚度[（81．32±7．09）μm]和真皮厚度[（352．75±40．08）μm]均较正常组[表皮（38．42±13．64）μm，真皮（188．50±27．83）μm]明显增加（P〈0．05），胶原纤维面积减少（分别为31．94％±8．56％和48．63％±11．32％，P〈0．05），异常弹性物质增多；模型组ROS含量（5124152．80±754119．22）DCF荧光强度／mg蛋白和MMP-13表达（3895．42±136．06）g／L均较正常组（分别为3502085．29±135089．06）DCF荧光强度／mg蛋白和（2414．73±105．96）g/L明显增高（P〈0．05）。与模型组比较，纳米金组皮肤外观及组织学特点均明显改善，小鼠皮肤厚度明显变薄，表皮（48．70±13．35）μm，真皮（253．74±36．28）μm（P〈0．05），且其表皮厚度恢复正常（P〉0．05），胶原纤维面积（41．54％±12．10％）增加（P〈0．05）；纳米金组ROS含量（3516963．35±67436．36）DCF荧光强度／mg蛋白和MMP-13表达（2558．25±102．72）g/L均较模型组明显降低（P〈0．05），且恢复至正常水平。用简单线性回归分析显示，ROS的产生量与MMP-13的表达量呈正相关（r=0．864，P=0．018）。结论纳米金的光热作用对小鼠光老化有一定的保护作用，其机制可能与其减少ICR小鼠皮肤组织中ROS产生，从而减少下游MMP-13表达有关。

套叠瓣在重建胆道中抗反流作用机制研究

目的:探讨胆支肠袢套叠瓣成形在胆肠Roux-en-Y吻合重建胆道术后的抗反流机制。方法:20只成年家兔随机均分为实验组和对照组。在胆总管结扎后,实验组行胆囊空肠Roux-en-Y吻合胆支肠袢套叠瓣成形胆道重建术,对照组仅行单纯胆囊空肠Roux-en-Y吻合术。术后饲养3个月,测量两组胆道顺流压和逆流压,并在测压同时给予造影。结果:胆道顺流压实验组为(5.91±1.46)cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa),对照组为(4.82±0.39)cmH2O;逆流压实验组为(14.32±1.67)cmH2O,对照组为(4.90±0.37)cmH2O。统计分析显示,两组间顺流压的差异无统计学意义(P>0.05),但逆流压实验组明显大于对照组(P<0.01);实验组逆流压明显大于自身顺流压(P<0.01),而对照组两者间差异无统计学意义(P>0.05)。造影结果显示,套叠瓣能阻止造影剂进入其上方胆支肠袢。结论:胆肠Roux-en-Y吻合重建胆道术后胆支肠袢套叠瓣通过增加Y袢胆臂逆流压而发挥抗反流作用。

缺乏可诱导共刺激信号的供体特异性输血促进受体鼠T细胞凋亡的体内研究

目的探讨缺乏可诱导共刺激分子(ICOS)/B7h信号的供体特异性输血(DST)对异基因小鼠心脏移植术后T细胞(Tc)凋亡的影响。方法按陈氏方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型,术后统计各组移植物的存活时间。实验分3组,异基因组:分别以BALB/c和C57BL/6为供、受体,不予治疗;同基因组:供、受体均为C57BL/6,不予治疗;治疗组:以BALB/c和C57BL/6为供、受体,给予治疗。通过流式细胞术检测受体鼠外周血CD8+ICOS+Tc亚群比例以及受体鼠引流淋巴结中CD8+Tc的凋亡情况。结果与异基因组比,治疗组中心脏移植物存活时间明显延长[(84.4±29.1)dvs.(7.0±0.8)d,P<0.01]。与异基因组比,治疗组外周血CD8+Tc亚群无明显缩减,而在CD8+ICOS+Tc亚群中,治疗组中显著低于异基因组[(7.5±2.0)%vs.(14.0±3.0)%,P<0.05]。与异基因组比,治疗组受体移植术后7d引流淋巴结中CD8+Tc凋亡比例显著上调[(19.5±5.1)%vs.(8.7±3.1)%,P<0.05]。结论通过ICOS/B7h信号的供体特异性输血预处理可以诱导引流淋巴结中CD8+Tc凋亡,这与受体外周血中CD8+ICOS+Tc亚群变化相关,可能在耐受的诱导过程中起重要作用。

Anti-TNF-α单克隆抗体对急性梗阻性黄疸大鼠心肌的保护作用

目的:探讨抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体(anti-TNF-α)对急性梗阻性黄疸大鼠心肌损伤的保护作用。方法:24只雄性SD大鼠随机均分为模型组(行胆总管结扎),治疗组(行胆总管结扎+anti-TNF-α治疗),假手术组。治疗组于胆总管结扎后第3天开始经尾静脉注射anti-TNF-α(1 mg/kg),连用5 d;模型组和假手术组以同样方法注射等体积的生理盐水。术后7 d,分别检测各组大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和TNF-α水平,以及大鼠心肌组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,并观察心肌组织形态学改变。结果:除假手术组外,模型组和治疗组大鼠术后3 d开始均出现黄疸,并逐渐加重。与假手术组比较,模型组和治疗组大鼠术后7 d血清CK-MB,TNF-α水平及心肌组织中MDA含量明显升高,SOD活性明显降低(均P<0.01),但治疗组以上指标的改变不如模型组明显,差异均有统计学意义(均P<0.01)。光镜下可见假手术组心肌无明显病理改变,模型组心肌纤维稀疏、变细、坏死,心肌细胞浊肿,治疗组比模型组心肌损伤减轻。结论:TNF-α可能是急性梗阻性黄疸后大鼠心肌损伤的重要介导因子,anti-TNF-α可以通过拮抗TNF-α而减轻急性梗阻性黄疸时大鼠的心肌损伤。

大鼠门静脉分支残端置管模型构建及细胞移植途径的评价

目的:大鼠肝部分切除模型被广泛的应用于肝脏疾病的研究,随着干细胞治疗肝损伤及护肝药物研究的发展,对大鼠肝损伤模型也提出了很多新的要求。本实验拟在大鼠肝部分切除术的基础上改进以建立大鼠肝断面门静脉分支残端的静脉置管模型,并进行细胞移植实验,对比分析新模型的优劣。方法:60只F344大鼠分为三组。A、B组行行85%肝切除术;C组行85%肝切除术+肝断面门静脉分支残端置管术。术中B组经门静脉注入4×105个表达GFP(green fluorescence protein,GFP)的胎肝干细胞(fetal liver stem/progenitor cells,FLSPCs)。C组经留置导管注射入同等量的FLSPCs,A组注射同等剂量的培养液。72小时取血清,测定肝功能ALT、AST,统计死亡率;取肝脏组织切片观察其修复情况。统计学采用方差分析和LSD-t检验。结果:B、C组F344大鼠72小时肝功指标(ALT、AST)均明显优于A组;B组、C组肝脏组织学的病理损伤的恢复分别较A组快。B、C组间肝功指标无统计学意义。结论:经门静脉分支残端置管途径移植FLSPCs效果等同于经门静脉穿刺途径,且该模型具有可反复、可选时、减少创伤等优点。

抑制Claudin-3表达对体外培养鼠视网膜神经节细胞的作用研究

目的 观察腺相关病毒（AAV）介导小发夹RNA（shRNA）干扰抑制Claudin-3表达对体外培养小鼠视网膜神经节细胞（RGC）的影响.方法 原代培养小鼠RGC分为正常对照组、AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组.细胞接种24 h后,AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组RGC分别转染AAV-shScramble和AAV-shClaudin3.转染96h后,活细胞荧光动态显微镜观察目的病毒转染效率;β-微管蛋白免疫荧光染色检测RGC轴突长度;免疫荧光4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色观察RGC凋亡形态;实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组RGC Claudin-3、血管内皮生长因子（VEGF） mRNA表达;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组RGC Claudin-3、VEGF、B淋巴细胞瘤/白血病-2基因（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表达水平.结果 活细胞动态荧光显微镜观察发现,AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组RGC病毒转染效率均＞50％;病毒转染96 h后,AAV-shClaudin3组RGC轴突长度明显低于正常对照组、AAV-shScramble组,差异有统计学意义（F=2 363.274,P＜0.05）;AAV-shClaudin3组RGC密度较正常对照组、AAV-shScramble组明显减低,可见细胞核皱缩、趋边以及细胞核裂解形成的凋亡小体.AAV-shClaudin组RGC的Claudin-3、VEGF mRNA表达明显低于正常对照组和AAV-shScramble组,差异有统计学意义（F=257.408、160.533,P＜0.05）.AAV-shClaudin3组RGC的Claudin-3、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显低于正常对照组和AAV-shScramble组,差异有统计学意义（F=129.671、420.552、62.669,P＜0.05）;Caspase-3蛋白表达明显高于正常对照组、AAV-shScramble组,差异有统计学意义（F=231.348,P＜0.05）.结论 AAV介导shRNA干扰抑制Claudin-3的表达可下调VEGF、Bcl-2及上调Caspase-3的表达,促进RGC凋亡,抑制RGC轴突生长.

神经干细胞玻璃体腔移植对糖尿病大鼠视网膜功能及结构的影响

目的 观察玻璃体腔注射人脐带间充质干细胞（hUCMSC）体外诱导的神经干细胞（NSC）对糖尿病大鼠视网膜功能及结构的影响。方法 健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，随机分为正常对照组（A组）、糖尿病组，分别为9、31只。糖尿病组大鼠经腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型。成模10周时，将建模成功的27只大鼠随机分为糖尿病对照组（B组）、玻璃体腔注射磷酸盐缓冲液组（C组）、玻璃体腔注射NSC组（D组），各组均为9只大鼠。A、B组不进行干预。干预后2、4、6周A^D组大鼠均行闪光视网膜电图检查，暗适应条件下记录暗适应视杆细胞反应（Rod-R）b波潜伏期和振幅以及最大混合反应（Max-R）a、b波潜伏期和振幅、振荡电位（OPs）总振幅。苏木精-伊红染色观察各组大鼠视网膜形态结构变化。结果 干预后2、4周，A～D组大鼠暗适应Rod-R b波振幅、Max-R a、b波潜伏期及振幅、OPs总振幅比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；D组暗适应Rod-R b波振幅、Max-R b波振幅、OPs总振幅较B、C组提高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Max-R b波潜伏期较B、C组下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预后6周，D组暗适应Rod-R b波振幅、Max-R a、b波振幅、OPs总振幅较B、C组提高，差异有统计学意义（P＜0.05）；D组Rod-R、Max-R b波潜伏期较C组下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。建模后10周，与A组比较，糖尿病组大鼠视网膜各层细胞排列紊乱。干预后2周，与A组比较，B、C组视网膜各层细胞排列紊乱，内界膜连续性破坏，局部增厚；4周，D组视网膜各层细胞排列紊乱，视网膜神经节细胞数量较B、C组增多，血管扩张不明显。结论 玻璃体腔注射hUCMSC体外诱导的NSC对糖尿病大鼠视网膜功能及结构均有改善作用。