Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡实验

课程组面向本科生开设了利用Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡的实验项目。该实验加入化疗药物依托泊苷(简称VP-16)诱导Jurkat细胞发生凋亡,使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况,在荧光显微镜下拍照计数。实验结果表明:紫外光激发下,早期凋亡细胞呈现绿色荧光,而晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现红色荧光;对细胞计数可知,对照组各时期细胞数符合正常范围,经药物处理后,各时期细胞凋亡率随药物浓度升高而升高,其中早期和晚期凋亡细胞占比最高;在高浓度药物处理后,细胞被大幅度杀伤,仅剩余几个早期凋亡细胞。实验将Annexin V-FITC/PI试剂盒与荧光显微镜结合使用,突破了教学经费、规模和仪器等条件局限,实验成本相对较低,适于大班教学,实验结果直观便捷,能够让学生深入、系统地掌握细胞凋亡的实验原理和检测方法,符合本科生实验项目的综合性高、设计性强和研究性佳的特点,切实提升细胞生物学实验课程的质量和水平。

~99TC^m-HYNIC-Annexin V的制备及其在健康小鼠体内的分布

目的制备人膜联蛋白 V(Annexin V),应用联肼尼克酰胺(HYNIC)偶联后进行^(99)Tc^m 标记,评价^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 在健康小鼠体内的分布。方法采用基因工程方法构建 Annexin V 的原核载体并诱导其表达,与自行合成的双功能螯合剂 HYNIC 偶联,并进行^(99)Tc^m 标记。测定^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 的标记率、放化纯,并研究其在健康小鼠体内的生物分布特性。结果 Annexin V在大肠杆菌中获得稳定表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及 Western Blot-ting 检测,得到纯度较高的蛋白质。Annexin V 经 HYNIC 偶联后,其^(99)Tc^m 标记率可达90%左右,放化纯>90%。小鼠体内分布结果表明,^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 血液清除迅速,主要从肾脏和肝脏排泄。结论 Annexin V 可在原核生物中稳定表达。其与 HYNIC 偶联后,^(99)Tc^m 标记率和放化纯较高,方法简单,条件温和。

99~Tc^m-HYNIC-Annexin V荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡显像研究

目的研究^(99)Tc^m-联肼尼克酰胺-膜联蛋白 V(HYNIC-Annexin V)的制备及其在荷瘤小鼠体内生物分布特性和活体显像。方法用双功能螯合剂法,以^(99)Tc^m 标记 Annexin V,经高效液相色谱仪分离纯化并检测产物的标记率、放化纯及稳定性。建立荷 S180肉瘤小鼠模型,于20～25g/只昆明种小白鼠右前腋皮下接种 S180肉瘤细胞1周。荷瘤小鼠在环磷酰胺腹膜内化疗72 h 后,尾静脉注射7.4 MBq(200μl)^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V,分别于5、30 min 和1、3、6 h 进行显像和体内生物分布测定。实验结果应用 SPSS 12.0统计软件进行分析。结果 ^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 的标记率达95%,放化纯为99%。荷瘤小鼠注射^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 后6 h 显像,可见肿瘤组织放射性浓聚明显异常。体内生物分布实验示,注射显像剂后6 h 肿瘤组织的放射性摄取最高[每克组织百分注射剂量率(%ID/g)为1.59±0.44],与其他时相比较,差异有显著性(P<0.05)。^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 主要浓聚于肾、肺和肝,经肾脏排泄;其在血液中清除速度快,注射后30 min,血液放射性摄取[(1.59±0.50)%ID/g]较注射后5 min 时[(8.85±2.65)%ID/g]减少80%(P<0.05)。注射显像剂后6 h,肿瘤/肌肉放射性摄取比值(3.73±1.42)高于肿瘤/血液(2.80±0.54)。结论 ^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 活体细胞凋亡显像可应用于荷瘤小鼠模型,其临床应用有待进一步研究。

放射性Annexin V活体检测细胞凋亡的研究进展

概述了放射性AnnexinV活体检测细胞凋亡的研究状况,介绍了这类显像剂在医学临床研究上的优越性,并对放射性标记AnnexinV显像剂的研究方法和进展进行了评述。

流式细胞术PI、Annexin V/PI和APO2.7法检测细胞凋亡的比较

目的:探讨流式细胞术PI法、APO2.7法以及AnnexinV/PI法三种凋亡检测方法的应用价值。方法:使用PI法、APO2.7法以及AnnexinV/PI法三种方法同时对槲皮素处理后的慢性粒细胞白血病K562细胞进行凋亡检测对比研究。结果:三种方法不同时间组间的相关系数分别为0.823(P>0.05),0.949(P<0.05),0.994(P<0.01)。药物作用24小时组APO2.7法与AnnexinV/PI法检测细胞凋亡相关系数为0.925(P<0.05),48小时组相关系数为0.993(P<0.01)。结论:流式细胞术检测凋亡时可以选用AnnexinV/PI法和APO2.7法,不推荐选用PI法。

Annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的比较

目的比较annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的优缺点。方法用DEX诱导胸腺细胞凋亡和H2O2诱导K562细胞系细胞凋亡,应用Hoechst33342/PI和annexin V-FITC/PI双色标记流式细胞术检测体系检测细胞凋亡情况。结果 Annexin V-FITC/PI双标记法能准确地反映2种模型中的细胞凋亡情况,与其检测原理一致;而Hoechst33342/PI双标记法虽能准确反映DEX诱导胸腺细胞的凋亡情况,但在检测H2O2诱导的K562细胞凋亡时,其早期凋亡细胞的分布与其检测原理明显不符。结论与annexin-V-FITC/PI双标记法相比,Hoechst33342/PI双标记法有一定的局限性。

米非司酮和利洛司酮诱导异位子宫内膜间质细胞Fas及Annexin V表达的研究

目的 :观察抗孕激素米非司酮和利洛司酮在不同浓度和作用时间下 ,对异位子宫内膜间质细胞Fas和钙磷脂结合蛋白V表达的影响。方法 :应用ELISA法检测培养基上清液中Fas蛋白的浓度。应用流式细胞仪检测AnnexinV表达。结果 :抗孕激素各药物浓度组Fas表达显著高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,且Fas浓度呈时间 剂量依赖性升高。抗孕激素10 - 6 mol/L和 10 - 5mol/L浓度组异位间质细胞AnnexinV表达显著高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,并呈时间 剂量依赖性增加。抗孕激素 10 - 5mol/L时培养异位子宫内膜间质细胞 4 8h和 72h ,利洛司酮组AnnexinV表达显著高于米非司酮组 (P <0 .0 5 )。结论 :米非司酮和利洛司酮以时间和剂量依赖性方式促进异位子宫内膜间质细胞凋亡。这两种药物可能通过上调Fas蛋白表达促进异位间质细胞凋亡。

^(99)Tc^m标重组H-Annexin V在动物血栓显像中的研究

目的评价人膜联蛋白 V(H-Annexin V)对血栓的亲和性,对^(99)Tc^m直接标记 H-Annexin V与通过联肼尼克酰胺(HYNIC)螯合标记 Annexin V 进行比较。方法在3种不同的反应条件下,分别用^(99)Tc^mO_4^-直接标记 Annexin V、H-Annexin V 及 HYNIC-Annexin V,然后测定标记率、稳定性及对兔股动脉血栓模型进行γ显像,比较损伤侧(T,血栓)及对侧(NT)的放射性比值。结果在还原剂足量的情况下,^(99)Tc^mO_4^-直接标记 H-Annexin V 方法简便,反应条件易于控制,^(99)Tc^m-H-Annexin V标记率达95%以上,17 h 后测放化纯仍>80%,血栓显像示动脉损伤处有明显的放射性浓聚,损伤处平均放射性计数为健侧放射性计数的3.714倍。结论 ^(99)Tc^m-H-Annexin V 与血栓具有很好的亲和力,标记率及稳定性高,标记方法较为简单。

^(99)Tc^m-Annexin V衍生物的制备及其生物分布和凋亡显像

目的探讨^(99)Tc^m 直接标记带有10个连续组氨酸的膜联蛋白 V(Annexin V)衍生物的可行性,研究其在健康小鼠体内的分布和肺癌裸鼠模型凋亡显像。方法直接标记法制备^(99)Tc^m-Annexin V 衍生物,并测产物放化纯、胶体含量及健康小鼠体内不同时间点(5,30 min 和1,2,4,6,12,24 h)的生物分布,DAS 2.0软件拟合计算药代动力学参数。建立荷 H460非小细胞肺癌裸鼠模型,分为紫杉醇诱导化疗组(5只)和未治疗对照组(5只)。紫杉醇诱导化疗后48 h,于裸鼠尾静脉注射^(99)Tc^m-Annexin V 衍生物18.5 MBq,2和4 h 时进行凋亡显像,勾画 ROI 并计算肿瘤与对侧正常组织(T/NT)放射性比值。结果放化纯达(98.01±1.67)%,3 h 后放化纯仍可达(95.45±1.34)%,胶体含量为(3.31±1.37)%。健康小鼠体内分布实验表明肾脏对该示踪剂摄取最高,肝、脾摄取较少。DAS 2.0软件拟合得到时间-放射性曲线符合二室模型特征,分布相半衰期(T_(1/2α))为(21.18±5.95)min,清除相半衰期(T_(1/2β))为(69.32±0.10)min。荷瘤鼠显像示,给药后2 h 即可获得清晰的图像,紫杉醇诱导化疗组2和4 h 的 T/NT 比值为3.85±1.10和4.63±0.97,明显高于对照组(1.60±0.29和1.71±0.43,P<0.01)。结论该Annexin V 衍生物易于^(99)Tc^m直接标记,方法简便,标记物在血液中清除迅速,肝、脾摄取少,易得到高清晰图像。

单次化疗后肿瘤内^99Tc^m-Annexin V的分布与bcl-2、bax蛋白表达的相关性研究

采用^99Tc^m-rh-Annexin V作为核素凋亡显像示踪剂，观察小鼠单次化疗后肿瘤内bcl-2与bax蛋白的表达。结果显示，单次化疗后化疗组肿瘤组织的放射性摄取百分数（％／g）、阳性细胞数及bax蛋白表达均明显多于对照组（P〈0．01）；bcl-2蛋白表达两组间差异无显著性（P=0．220）；化疗组bcl-2／bax明显高于对照组（P〈0．01）。相关性研究表明，对照组与化疗组肿瘤组织的放射性摄取百分数与TUNEL阳性细胞数均呈明显正相关（r=0．801，r=0．769）。对照组肿瘤组织内bax蛋白表达与放射性摄取及TUNEL阳性细胞数均呈明显正相关（r=0．849、0．652），bcl-2／bax比值与放射性摄取百分数及TUNEL阳性细胞数均呈明显负相关（r=-0．820、-0．694）。以上结果提示，肿瘤组织内^99Tc^m-rh-Annexin V的分布可以反映化疗后早期肿瘤组织细胞凋亡的状况以及凋亡调控蛋白bax表达水平的变化。

用~99Tc^m-rh-Annexin V检测放疗或化疗后肿瘤细胞凋亡

目的验证^(99)Tc^m 直接法标记的重组入膜联蛋白 V(^(99)Tc^m-rh-Annexin V)用于早期评价放化疗后肿瘤组织细胞凋亡状态的可行性。方法将小鼠肝癌细胞(Hca-F25)接种于实验小鼠右腋下,8 d 后当肿瘤生长至直径约1 cm 时,将模型鼠分为 A(化疗组,13只)、B(放疗组,10只)、C(荷瘤对照组,12只)3组。其中 A、C 组按注射示踪剂后不同时间(1、4、6 h)各分为3个亚组(A1组3只,A2组4只,A3组6只;C1组3只,C2组4只,C3组5只);A 组接受环磷酰胺单次化疗(按体重150 mg/kg,腹腔内注射),C 组腹腔内注射同等量生理盐水,20 h 后 A、C 组鼠尾静脉注射^(99)Tc^m-rh-Annexin V 3.7MBq(0.5 μg)/只。B 组按不同吸收剂量(2、5、10 Gy)分为3个亚组(B1组4只,B2组3只,B3组3只),放疗后1 h 注射与 A、C 组相同剂量示踪剂,6 h 后显像。小鼠模型显像后即刻处死,取组织(肿瘤、血、肌肉)称重后,测量放射性计数,并计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)及肿瘤(T)/肌肉(M)、T/血液(B)放射性比值,应用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。结果 A、B 组小鼠肿瘤组织中凋亡细胞百分率[(11.16±3.83)%、(17.40±5.20)%]均明显高于 C 组[(2.11±1.51)%,F=56.414、94.748,P<0.001];A2、A3及 B 组肿瘤组织%ID/g 均明显高于 C2及 C3组(F 值分别为14.307、7.074、28.672,P 均<0.05),且与凋亡细胞百分率呈明显正相关(A2、A3组:r=0.813,P=0.002;B组:r=0.780,P=0.004),而 C 组肿瘤组织%ID/g 与凋亡细胞百分率无相关性(r=-0.238,P=0.229)。结论接受放疗或化疗后,小鼠肝癌组织对^(99)Tc^m-rh-Annexin V 的摄取明显增加,且其摄取程度与肿瘤组织内凋亡细胞量呈明显正相关;应用^(99)Tc^m-rh-Annexin V 显像可较准确地反映治疗后早期肿瘤组织细胞凋亡的状态。

探讨HBsAg/Annexin V检测在HBV宫内传播中的意义

目的 :揭示乙肝病毒 (hepatitisBvirus,HBV)感染胎盘滋养层细胞的可能方式 ,探讨乙肝表面抗原 /膜联蛋白V(HBsAg/AnnexinV)检测在HBV宫内传播机制研究的意义 .方法 :收集血清学HBsAg阳性孕妇足月胎盘组织 39例 ,经SABC免疫组化方法在其中 2 3例中检测到HBsAg ,随机选取 7例采用免疫荧光双标记方法结合激光共聚焦技术检测HBsAg/An nexinV .结果 :血清学HBsAg阳性孕妇足月胎盘组织中HB sAg/AnnexinV共存于滋养层细胞胞质中 .结论 :提示在HBV宫内传播机制方面存在着这样一种可能 ,即AnnexinV结合并携带HBV进入滋养层细胞 ,从而使滋养层细胞受到HBV感染 .

Annexin V法检测盐胁迫下烟草原生质体的早期凋亡

将膜联蛋白V(Annexin V)法与碘化丙啶(PI)染色法相结合检测烟草(Nicotiana tabacum L.)原生质体的早期凋亡,结果表明:在中性盐胁迫下,能够很好地区分早期凋亡的原生质体和死亡的原生质体。200 mmol.L-1NaCl对烟草原生质体胁迫5 h,凋亡率能达到7.57%;但在200 mmol.L-1NaHCO3碱性盐胁迫下,质膜透性发生了改变,不易区分早期凋亡的原生质体和死亡的原生质体,同时,随着碱性的增加,原生质体破碎率显著升高。碱性的NaHCO3和Na2CO3表现出对细胞膜的破坏作用。

胎盘组织中Human Annexin V的表达及与HBV感染的关系

目的观察Human AnnexinV(HAV)在胎盘组织中的表达,并探讨其在乙型肝炎病毒(HBV)感染胎盘中的可能作用。方法用免疫荧光染色法检测早孕绒毛,中孕和足月胎盘绒毛中HAV的表达;用免疫荧光双重染色法观察HBV感染的胎盘组织HBsAg和HAV的分布及相互关系。结果①所有的标本绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、毛细血管内皮细胞都有HAV的存在。②HBV感染的胎盘绒毛中只要是HBsAg阳性的部位同时一定有HAV的表达,阳性信号存在于滋养层细胞、绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞中。结论HAV可能作为HBsAg的特异性受体介导了HBV与胎盘组织各层细胞的粘附、内化等过程并最终导致了HBV对胎盘的感染。

PI法和Annexin V/PI法检测蓝舌病毒HbC_3诱导人肝癌细胞的凋亡

利用流式细胞仪比较PI法和AnnexinV/PI法检测不同时间人肝癌细胞感染蓝舌病毒HbC3的凋亡率分析。结果:PI法在24h、36h、48h的凋亡率分别为10.8±3.05、21.7±6.28、28.3±10.6;AnnexinV/PI法的凋亡率分别为20.42±3.70、49.3±8.11、79.6±11.5。二种方法及不同时间感染病毒细胞的凋亡率之间有显著差异(P<0.01)。证明了AnnexinV/PI法能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞、继发性坏死的细胞,BTV-HbC3诱导Hep-3B细胞凋亡是致肿瘤细胞病变、死亡的重要表现形式之一。

^(99m)Tc-Annexin V检测早期凋亡多巴胺能神经元的实验研究

目的研究放射性核素标记的膜联蛋白V(Annexin V)与凋亡的多巴胺能神经元的结合特性,探讨使用凋亡显像剂99mTc-Annexin V早期活体显像诊断帕金森病的可行性。方法采用不同浓度的1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)处理大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)以诱导其凋亡(PC120~200μm/L,SH-SY5Y0~500μm/L),FITC-Annexin V及碘化吡啶(pro-pidiumiodide,PI)双染进行流式细胞仪凋亡检测。以99mTc-Annexin V与凋亡的细胞进行饱和结合实验及细胞摄取实验,研究凋亡细胞与Annexin V的亲和力及其摄取99mTc-Annexin V的动力学。结果MPP+可诱导PC12细胞及SH-SY5Y细胞发生凋亡,并有明显的量效关系。凋亡细胞可特异性与99mTc-Annexin V结合,亲和力可达(7.16±1.78)nmol/L,每个凋亡的多巴胺能神经元表面的结合位点可达到(179±33)f mol/106cells(PC12)及(220±26)f mol/106cells(SH-SY5Y),且神经元的凋亡水平与其膜结合的99mTc-Annexin V放射性强度有相关性(P<0.001)。结论凋亡的多巴胺能神经元与99mTc-Annexin V有高度亲和力,其所结合的99mTc-Annexin V放射性强度与细胞的凋亡水平相关,99mTc-Annexin V可用于检测多巴胺能神经元的早期凋亡。

Annexin V的^(125)I标记及其在正常小鼠体内的分布

采用Iodogen法对Annexin V进行了125I标记,并观察了其在正常小鼠体内的分布情况。标记结果显示,125I-Annexin V标记率达94.9%,纯化后放化纯度达99%;室温放置72 h后,放化纯度仍保持在92%以上,表明其体外稳定性较好。生物分布结果显示,125I-Annexin V在肾脏中放射活性最高,其次为血液、肝脏、心、肺、脾;脑不吸收125I-Annexin V;肌肉、骨骼组织摄取亦较少;各组织、器官放射性摄取在1 h内除血液下降稍慢外,其余均有明显下降。表明125I-Annexin V适合用作核医学诊断试剂。

^(153)Sm-Annexin V凋亡显像的实验研究

目的:探讨放射性核素153Sm标记Annexin V凋亡显像的可行性。方法:采用环二乙三胺五醋酸(DTPA)法进行153Sm-Annexin V制备,并进行物理、化学及生物学检测。应用153Sm-Annexin V进行体外细胞培养及荷瘤小鼠动物凋亡显像实验。结果:经环DTPA法制备的153Sm-Annexin V无色透明,pH为7.4,比活度100μg/10 mCi/2 mL;放化纯RCP>90%,标记率为88.6%;无菌,无热原,LD50>333μg/kg体质量,血浆半衰期13 min;体外细胞培养及荷瘤小鼠动物凋亡显像实验均阳性。结论:153Sm-Annex in V作为放射性核素凋亡显像剂,标记率高,半衰期相对较长,利于进行连续追踪监测、捕捉细胞凋亡活动的高峰期,进而确立最佳凋亡显像时间窗,有广泛的临床应用前景。

~99Tc^m-HYNIC-Annexin V的制备及其与多巴胺能神经元凋亡模型的结合特性

目的研究凋亡显像剂^(99)Tc^m-人膜联蛋白V(Annexin V)的制备及其与多巴胺能神经元凋亡模型的体外结合特性。方法运用双功能螯合剂联肼尼克酰胺(HYNIC)进行^(99)Tc^m 标记 Annexin V,形成^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V,经 Sephadex G-25柱层析分离纯化,采用快速薄层层析(ITLC)法检测放化纯。将^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 与经过1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP^+)处理制模的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞进行体外细胞量及时间-温度结合实验、饱和结合实验和竞争结合实验.得到^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 与多巴胺能神经元凋亡模型的结合特性,并比较其与正常细胞及不同凋亡水平下细胞模型的结合特性。结果①^(99)Tc^m-YNIC—Annexin V 标记率(64.56±6.23)%,比活度(3.7～74)×10~5kBq/mg,放化纯(93.6±2.48)%,室温放置4 h 后放化纯仍大于90%。②^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 与多巴胺能神经元凋亡模型的结合具有特异性、可饱和性,Scatchard 图示平衡解离常数(K_d)为(7.16±1.78)nmol/L,最大结合容量(B_(max))为(178.73±32.62)fmol/10~6细胞。结论多巴胺能神经元凋亡模型对^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 有良好的摄取,可进一步行动物体内研究。

放疗后早期肿瘤组织内^99Tc^m-rh-Annexin V分布与Survivin、Caspase-3蛋白表达的相关性研究

采用^99Tc^m-rh-Annexin V作为凋亡显像示踪剂，观察小鼠放疗后早期肿瘤组织内Survivin、Caspase-3蛋白表达。结果显示，放疗组肿瘤组织内^99Tc^m-rh-Annexin V分布、TUNEL检测阳性细胞数及Caspase-3蛋白表达均明显多于对照组，Survivin蛋白表达A组明显高于B组，差异均存在显著性（P均＜0．01）。相关性研究表明，肿瘤组织的放射性摄取与TUNEL阳性细胞数呈明显正相关（r=0．942，P=0．000）；肿瘤组织内Survivin蛋白表达与Caspase-3蛋白表达呈明显负相关（r=-0．836，P=0．000）。肿瘤组织内^99Tc^m-Annex-inV分布与Caspase-3蛋白表达呈明显正相关（r=0．948，P=0．000），与Survivin蛋白表达呈明显负相关（r=-0．819，P〈0．01）。以上结果提示，肿瘤组织内^99Tcm—rh—Annexin V的分布可以反映放疗后早期肿瘤组织细胞凋亡的状况以及凋亡调控蛋白Survivin、Caspase-3表达水平的变化。