碳量子点(CDs)耦合Annexin-V抗体复合物活体SD大鼠周围神经功能束鉴别的基础研究

目的:探寻术中可用的周围神经功能束鉴别的方法。方法:分组制备SD大鼠双侧股神经主干、股神经肌支及隐神经Sunderland V损伤模型,制备的Annexin V-碳量子点(Carbon quantumdots,CDs)抗体复合物涂抹神经断端,在380 nm紫外灯激发光源照射下,5、10、15和20 min后在荧光显微镜下观察荧光显色。结果:SD大鼠双侧股神经主干、股神经肌支及隐神经Sunderland V损伤断端染色5 min荧光强度不足以充分显示神经束;染色10~15 min强度明显增加,股神经主干的感觉束及隐神经在Annexin V-CDs抗体复合物染色下呈蓝色荧光,股神经主干的运动束及股神经肌支无荧光显示;染色20 min后荧光强度逐渐减弱。各分组组内样本染色5、10、15、20 min的染色强度无明显差异。结论:Annexin V-CDs抗体复合物能够实现术中SD大鼠周围神经功能束的鉴别。

HBV感染相关蛋白Human Annexin-V在卵巢组织表达

目的:观察HBV感染相关蛋白—人膜联蛋白V(Human Annexin-V,HA-V)在卵巢组织,特别是卵细胞上的表达,探讨其在HBV感染卵巢及卵细胞中的可能作用。方法:用SP免疫组化的方法检测HA-V在引产胎儿卵巢及卵细胞,血清HBsAg阳性及阴性的成人卵巢、卵细胞上HA-V的表达及分布。结果:①所有卵巢组织均有HA-V的表达,与HBsAg阳性与否及卵巢成熟无关。阳性表达分布于卵巢的卵细胞(包括原始卵细胞、初级卵母细胞、次级卵母细胞及成熟卵母细胞)、颗粒细胞及间质细胞。②免疫组化图像分析系统显示血清HBsAg阳性成人卵巢与血清HBsAg阴性成人卵巢及胎儿卵巢HA-V表达无明显差别。结论:HA-V是卵巢组织及卵细胞上的一种固有蛋白;HA-V可能作为HBsAg的特异性受体介导了HBV与卵巢组织各种细胞,特别是卵细胞的粘附、内化等过程并最终导致了HBV对卵巢及卵细胞的感染。

苦参碱对NCI-N87胃癌细胞增殖凋亡及bcl-2蛋白表达的影响

目的:探讨不同浓度苦参碱对体外培养的人胃癌细胞NCI-N87的增殖、凋亡及bcl-2蛋白表达的影响。方法:NCI-N87细胞经不同浓度苦参碱处理后,采用CCK-8法检测药物对肿瘤细胞的抑制作用,显微镜观察细胞形态学改变;应用流式细胞仪分析苦参碱对细胞凋亡和bcl-2蛋白的影响。结果:苦参碱浓度>3mg/mL,细胞毒作用较大;浓度在0.5～2.0mg/mL时,对肿瘤细胞的生长有抑制作用,且呈时间剂量依赖性;浓度在0.1mg/mL,对肿瘤细胞生长几乎无抑制作用。流式细胞仪分析结果显示,细胞凋亡百分率随着药物浓度的增加和作用时间的延长而增加,而bcl-2蛋白则随之下降。结论:苦参碱对人胃癌细胞NCI-N87增殖有抑制作用,并能诱导细胞凋亡,下调bcl-2蛋白水平。

益胃饮含药血清对胃癌细胞MFC增殖凋亡及NR4A3/HGF表达的影响

目的：探讨不同浓度益胃饮对体外培养的胃癌细胞MFC的增殖、凋亡及NR4A3蛋白表达的影响。方法：MFC细胞经不同浓度益胃饮含药血清处理后,采用MTT法检测药物对肿瘤细胞的抑制作用,显微镜观察细胞形态学改变;采用流式细胞仪及Annexin V/PI染色的方法检测益胃饮含药血清对MFC胃癌细胞周期及凋亡的影响,并以RT-PCR芯片技术（Mouse TumorM etastasis PCR Array）分析该方对胃癌细胞MFC肿瘤相关基因表达的影响;结果：益胃饮含药血清浓度在4%~12%时,对肿瘤细胞的生长有抑制作用,且呈时间剂量依赖性。流式细胞仪分析结果显示,细胞凋亡百分率随着药物浓度的增加和作用时间的延长而增加,而RT-PCR芯片技术分析结果显示NR4A3表达则随之增强而HGF显著下调。结论：益胃饮含药血清对人胃癌细胞MFC增殖有抑制作用,并能诱导细胞凋亡,其作用机制可能是益胃饮通过促进Nr4 a3表达,下调HGF而达到的。

流式细胞术三种染色方法检测体外纯化扩增的NK细胞的细胞毒作用比较

目的:比较流式细胞术3种不同染色方法检测体外诱导扩增后NK细胞的细胞毒活性效果。方法:收集健康志愿者外周血,体外诱导扩增NK细胞,在培养第17天后分为3组,每组按10∶1、20∶1、40∶1 3个效靶比混合,共同培养4 h,并分组用3种不同方法染色后经流式细胞术检测。A组:CFSE/Annectin-V/7-AAD三色荧光染色法;B组:Annectin-V/PI双色荧光染色法;C组:CFSE/PI双色荧光染色法。结果:培养17 d后,NK细胞(CD3-CD56+)由培养第0天(16.34±10.51)%增加到(83.63±10.63)%(P<0.05)。3种染色方法检测结果均显示,扩增后NK细胞对K562细胞具有显著细胞毒活性:A组NK细胞对K562细胞的细胞毒活性均明显高于B和C组(P<0.05),当效靶比为10∶1时,A、B和C 3个组细胞毒活性分别为(36.56±3.69)%、(22.35±2.71)%和(10.85±2.09)%;当效靶比为20∶1时细胞毒活性分别为(47.83±5.52)%、(39.07±5.55)%和(29.61±4.81)%;当效靶比为40∶1时细胞毒活性则分别为(67.7±4.77)%、(51.51±4.43)%和(44.12±5.62)%,差异均有显著统计学意义(P<0.05)。结论:健康者外周血经体外分离培养,可得到高纯度NK细胞;流式细胞检测技术CFSE/Annectin-V/7-AAD三色荧光染色法能特异性地和灵敏地检测NK细胞的细胞毒活性。

阿糖胞苷对HL60细胞增殖和凋亡及bcl-2基因表达的影响

目的探讨阿糖胞苷(Ara-C)对急性早幼粒白血病细胞HL60增殖、凋亡及bcl-2基因表达的影响。方法 Ara-c与HL60细胞共同孵育后,应用光学显微镜和透射电子显微镜观察细胞的形态学变化,通过四唑盐(MTT)法分析不同剂量Ara-C对细胞增殖的抑制作用,应用流式细胞术分析Ara-C对细胞凋亡和Bcl-2蛋白的影响,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)研究bcl-2基因表达的影响。结果 250μg／ml Ara-C对HL60细胞作用48 h后,光学显微镜下可见细胞呈核固缩、深染及染色质边集等多种形态改变,透射电子显微镜下可见典型的凋亡细胞,MTT检测显示Ara-C能明显抑制细胞的生长。流式细胞仪分析结果显示,细胞凋亡百分率随作用时间的延长而增加,而Bcl-2蛋白则随之下降。RT-PCR结果显示,bcl-2 mRNA的表达亦随着药物作用时间的延长而下降。结论 Ara-C能诱导HL60细胞凋亡,下调Bcl-2蛋白及bcl-2 mRNA水平。

高表达GRIM-19诱导结肠癌SW480细胞凋亡

目的:研究干扰素/维甲酸诱导死亡基因(retinoid-interferon-induced mortality,GRIM-19)对结肠癌SW480细胞凋亡的影响。方法:构建GRIM-19真核表达载体(pCMV-Flag-GRIM-19),转染入SW480细胞中,Western blotting检测GRIM-19及凋亡相关蛋白Bal-xl的表达,采用Annexin-V/PI和线粒体膜电位JC-1染色检测SW480细胞的凋亡。结果:成功构建pCMV-Flag-GRIM-19真核表达载体。pCMV-Flag-GRIM-19质粒转染SW480细胞后,GRIM-19的表达上调,凋亡抑制蛋白Bcl-xl的表达则下调。转染空质粒pCMV-Flag组SW480细胞凋亡率为(7.7±1.39)%,转染pCMV-Flag-GRIM-19质粒后SW480细胞凋亡率为(15.0±2.52)%(P<0.05)。线粒体膜电位检测显示转染空质粒pCMV-Flag组SW480细胞膜电位降低细胞为(7.5±2.09)%,而转染pCMV-Flag-GRIM-19后细胞线粒体膜电位降低细胞为(17.5±3.07)%(P<0.05)。结论:GRIM-19体外转染可有效诱导结肠癌SW480细胞凋亡。

性控分离精子凋亡程度对牛体外受精的影响

采用Annexin-V、JC-1和TUNEL对A、B、C、D 4头种公牛性控X冻精进行了凋亡分析,并对凋亡分析结果与性控精液体外受精卵裂率和囊胚率的关系进行了相关分析。结果表明:(1)公牛A的活精子(AN-·PI-)百分率(89.30%±3.04%)高于其他公牛((74.39%±3.24%)^(81.17%±4.25%)),差异显著(P<0.05),而其DNA片段化精子百分率(12.24%±1.25%)低于其他公牛((19.09%±1.27%)^(27.56%±3.17%)),差异显著(P<0.05);(2)公牛A的X冻精体外受精(IVF)卵裂率、囊胚率((76.82%±3.00%)^(20.45%±1.44%))均高于其他3头公牛((22.00%±6.85%)^(31.88%±6.69%)),(3.33%±2.67%)^(4.00%±3.26%)),差异显著(P<0.05);(3)活精子百分率与其IVF卵裂率和囊胚率呈正相关,而DNA片段化百分率与之呈负相关。综上表明:Annexin-V分析能够准确地预测牛X性控冻精的体外受精效率,这对于促进牛性控体外胚胎的生产效率有着重要意义。

荷肺癌裸鼠化疗后凋亡指标表达的变化

众所周知,细胞凋亡是不同类型细胞受到程序化因素控制而发生的细胞死亡过程,它是不同于坏死的一种细胞死亡的过程.细胞凋亡在肿瘤发生和生长过程中具有重要作用[1].在细胞凋亡的早期检测中,主要检测的指标是Caspase-3和Annexin-V.Caspase-3是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族的成员之一,Annexin-V是磷脂结合蛋白.而细胞周期（DNA）法则用于晚期凋亡的检测.本文研究了Caspase-3和Annexin-V、细胞周期检测在常规化疗药物紫杉醇的抗癌机理中所起的作用.

用激光扫描共聚焦显微镜原位检测细胞凋亡

用激光扫描共聚焦显微镜在原位检测细胞凋亡具有多方面的优势。本文介绍用该仪器原位检测Annexin—Ⅴ试验样品、TUNEL试验样品及进行细胞凋亡形态学观察的过程和方法。

流式细胞术定量检测细胞凋亡3种方法的比较研究

目的：探讨流式细胞术定量检测细胞凋亡３ 种方法的价值。方法：同时使用ＰＩ染色、ＴＵＮＥＬ及Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＰＩ３ 种方法定量检测地塞米松处理小鼠的胸腺细胞凋亡发生率。结果：ＰＩ染色、Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＰＩ、ＴＵＮＥＬ３ 种方法凋亡检出率分别为２７．１９％ 、３２ ．２８％ 、５０ ．１７ ％ ，两两之间均有显著差异（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。但仅Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＰＩ法可将正常细胞、凋亡细胞、死亡细胞区分开来。结论：Ａｎｎｅｘｉｎ ＶＰＴ法是目前最为理想的凋亡定量检测方法。

食品中丙烯酰胺致小鼠睾丸生殖细胞凋亡的研究

为了解丙烯酰胺致小鼠生殖毒性的细胞凋亡机制,昆明种小鼠经丙烯酰胺(20、40、60mg/kg体重)慢性染毒8w后,应用末端转移标记技术(TUNEL)和流式细胞仪技术(Annexin-VFITC/PI)检测不同浓度丙烯酰胺对睾丸生殖细胞凋亡的影响。结果表明:两种方法检测结果均显示丙烯酰胺能引起睾丸生殖细胞的凋亡,而且随着浓度的增加细胞凋亡也逐渐增多,40、60mg/kg组的细胞凋亡率显著高于阴性对照(p<0.05),20mg/kg组的凋亡率虽然较阴性对照有所增加,但差异不显著;TUNEL法测定的细胞凋亡率高于Annexin-VFITC/PI,但两种方法测定结果无显著差异。可见,丙烯酰胺可以诱导小鼠睾丸生殖细胞发生凋亡,Annexin-VFITC/PI法及TUNEL法均能敏感检测出细胞凋亡,而且Annexin-VFITC/PI法具有更高的特异性。

幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃复制大鼠慢性萎缩性胃炎癌前病变模型形态学观察及早期细胞凋亡分析

目的:研究幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃法复制慢性萎缩性胃炎(CAG)癌前病变大鼠模型形态学及早期细胞凋亡特征。方法:采用幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃法复制CAG癌前病变模型,用双标记流式细胞术分析CAG癌前病变大鼠细胞凋亡的特征。结果:光镜观察表明CAG癌前病变模型复制成功,CAG癌前病变模型组大鼠早期凋亡率明显高于正常组(P<0.01)。结论:幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃法成功复制CAG癌前病变大鼠模型,细胞凋亡增强可能是CAG癌前病变的发病机制之一。

RBL-2H3细胞诊断过敏性休克的可行性初探

目的 :探索诊断过敏性休克的体外检测方法。方法 :建立豚鼠过敏性休克模型 ,培养RBL 2H3细胞株 ,用致敏动物血清在体外诱导该细胞脱颗粒 ,观察其形态改变及测定组胺释放量与细胞表面AnnexinV标记阳性率。结果 :RBL 2H3细胞在致敏血清刺激下活化 ,在抗原再次攻击后可以脱颗粒 ,AnnexinV阳性率与组胺释放量呈正比 ,二者与致敏血清的滴度呈剂量依赖关系。结论 :RBL 2H3可望用于过敏性疾病诊断及变应原筛选 。

苯对骨髓CD34+细胞及单个核细胞凋亡的影响

目的 探讨不同苯浓度作业场所对淋巴细胞微核和 /淋巴细胞百分比高的工人的骨髓CD34+ 细胞数量及单个核细胞AnnexinV ,Fas阳性表达率的影响。方法 对 2 0例淋巴细胞微核和 /淋巴细胞百分比偏高的苯作业工人和 10例正常人 ,采用流式细胞术检测CD34+ 细胞数量 ,单个核细胞AnnexinV和Fas的阳性表达率 ;气相色谱法测定作业场所苯浓度。结果 苯浓度 34～ 5 82mg/m3 作业工人骨髓CD34+ 细胞数量明显低于正常对照组 ,有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,相关分析呈负相关 (P <0 .0 5 ) ,r =- 0 .95。骨髓单个核细胞AnnexinV阳性表达率与Fas阳性表达率明显高于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ,相关分析呈正相关 (P <0 .0 5 ) ,r =0 .96 ;苯浓度 8～ 32mg/m3 作业工人骨髓仅CD34+ 细胞数量高于正常对照组。结论 动态测定苯作业工人骨髓CD34+ 细胞数量 。

~99TC^m-HYNIC-Annexin V的制备及其在健康小鼠体内的分布

目的制备人膜联蛋白 V(Annexin V),应用联肼尼克酰胺(HYNIC)偶联后进行^(99)Tc^m 标记,评价^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 在健康小鼠体内的分布。方法采用基因工程方法构建 Annexin V 的原核载体并诱导其表达,与自行合成的双功能螯合剂 HYNIC 偶联,并进行^(99)Tc^m 标记。测定^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 的标记率、放化纯,并研究其在健康小鼠体内的生物分布特性。结果 Annexin V在大肠杆菌中获得稳定表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及 Western Blot-ting 检测,得到纯度较高的蛋白质。Annexin V 经 HYNIC 偶联后,其^(99)Tc^m 标记率可达90%左右,放化纯>90%。小鼠体内分布结果表明,^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 血液清除迅速,主要从肾脏和肝脏排泄。结论 Annexin V 可在原核生物中稳定表达。其与 HYNIC 偶联后,^(99)Tc^m 标记率和放化纯较高,方法简单,条件温和。

四君子汤复方总多糖对肠黏膜Peyer's结细胞凋亡的影响

目的探讨四君子汤复方总多糖对小鼠肠黏膜Peyer's结细胞凋亡的影响。方法取NIH小鼠随机分为正常组、模型组、四君子汤复方总多糖(SJZPS)组和四君子汤去蛋白多糖(SJZFP)组,肉眼计数Peyer's结细胞个数和面积,流式细胞(FCM)定量分析法(Annexin V联合PI)测定Peyer's结细胞的凋亡率,免疫组化法测定Peyer's结细胞BCL-2蛋白的表达。结果模型组Peyer's结个数和面积均小于正常组,与模型组比较,SJZPS组和SJZFP组Peyer's结个数和面积,均具有非常显著性差异(P<0.01);模型组Peyer's结细胞凋亡率大于正常组,与模型组比较,SJZPS组和SJZFP组Peyer's结细胞凋亡率具有非常显著性差异(P<0.01);模型组Peyer's结BCL-2蛋白表达低于正常组,与模型组比较,SJZPS组和SJZFP组Peyer's结BCL-2蛋白表达具有非常显著性差异(P<0.01)。结论SJZPS和SJZFP均可抵抗肠黏膜Peyer's结细胞的凋亡,具有肠道黏膜免疫调节作用。

99~Tc^m-HYNIC-Annexin V荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡显像研究

目的研究^(99)Tc^m-联肼尼克酰胺-膜联蛋白 V(HYNIC-Annexin V)的制备及其在荷瘤小鼠体内生物分布特性和活体显像。方法用双功能螯合剂法,以^(99)Tc^m 标记 Annexin V,经高效液相色谱仪分离纯化并检测产物的标记率、放化纯及稳定性。建立荷 S180肉瘤小鼠模型,于20～25g/只昆明种小白鼠右前腋皮下接种 S180肉瘤细胞1周。荷瘤小鼠在环磷酰胺腹膜内化疗72 h 后,尾静脉注射7.4 MBq(200μl)^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V,分别于5、30 min 和1、3、6 h 进行显像和体内生物分布测定。实验结果应用 SPSS 12.0统计软件进行分析。结果 ^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 的标记率达95%,放化纯为99%。荷瘤小鼠注射^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 后6 h 显像,可见肿瘤组织放射性浓聚明显异常。体内生物分布实验示,注射显像剂后6 h 肿瘤组织的放射性摄取最高[每克组织百分注射剂量率(%ID/g)为1.59±0.44],与其他时相比较,差异有显著性(P<0.05)。^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 主要浓聚于肾、肺和肝,经肾脏排泄;其在血液中清除速度快,注射后30 min,血液放射性摄取[(1.59±0.50)%ID/g]较注射后5 min 时[(8.85±2.65)%ID/g]减少80%(P<0.05)。注射显像剂后6 h,肿瘤/肌肉放射性摄取比值(3.73±1.42)高于肿瘤/血液(2.80±0.54)。结论 ^(99)Tc^m-HYNIC-Annexin V 活体细胞凋亡显像可应用于荷瘤小鼠模型,其临床应用有待进一步研究。