高血压脑梗死与血浆热休克蛋白70抗体水平关系的研究

目的通过测定高血压脑梗死患者血浆热休克蛋白70(HSP70)抗体水平,探讨HSP70抗体与脑梗死损伤程度的关系及其在脑梗死发病机制中的作用。方法100例脑梗死患者经头颅CT或MRI确诊,其中男64例,女36例;高血压者67例,血压正常者33例。选100名社区居民作为对照组,其中男58名,女42名;高血压者35名,血压正常者65名。采用蛋白质免疫印迹酶联免疫吸附法(Western blot ELISA)测定血浆HSP70抗体,并进行Logistic回归分析。结果脑梗死组HSP70抗体阳性率明显高于对照组(69%比13%);脑梗死组高血压者HSP70抗体阳性率明显高于血压正常者(57%比12%),对照组高血压者HSP70抗体阳性率亦高于血压正常者(11%比2%)。上述结果差异均有显著性(P均<0.05)。结论HSP70抗体增多与高血压脑梗死发病相关,可作为高血压脑缺血时一种分子生物学诊断指标;HSP70抗体表达越强,脑梗死病情越严重。因此,HSP70抗体增高是反映脑组织损伤程度的标志。

猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定

以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别。以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠。筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11。Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应。抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF11分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链。相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位。

血清HSP 70抗体诊断子痫前期及评价疾病严重程度的研究

目的:探讨测定血清热休克蛋白70抗体(HSP70Ab)在子痫前期诊断中的临床价值。方法:选择2008年1至10月在天津医科大学总医院产科住院分娩的子痫前期患者48例(子痫前期组),其中轻度子痫前期组24例,重度子痫前期组24例,另选择同期产前检查健康、孕周相当的孕妇23例(正常妊娠组)。分娩前抽空腹血,采用ELISA方法检测两组孕妇血清中HSP70Ab的表达水平。结果:HSP70Ab在正常妊娠组为5.54±1.39ng/ml,子痫前期组为7.71±2.27ng/ml,其中轻度子痫前期组为6.00±1.56ng/ml,重度子痫前期组为9.35±1.50ng/ml,HSP70Ab在子痫前期组患者血清中表达较正常妊娠组升高(P<0.05),重度子痫前期与轻度子痫前期相比,其水平也升高,差异有统计学意义(P<0.05),但轻度子痫前期组与正常妊娠组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:子痫前期患者体内HSP70Ab水平增高,有助于子痫前期的诊断及评价子痫前期的严重程度,具有临床应用价值。

肉鸡HSP70的基因克隆、原核表达及单克隆抗体制备

【目的】制备高特异性的肉鸡热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)单克隆抗体,研究肉鸡HSP70与热应激损伤的关系。【方法】利用RT-PCR方法扩增肉鸡HSP70mRNA,将其扩增产物克隆到PGEM-T Easy载体和原核表达载体pET-28a(+)上,进一步转化至大肠杆菌BL-21中,用IPTG诱导表达重组肉鸡HSP70。以纯化的重组肉鸡HSP70制备多克隆抗体,免疫印迹分析说明重组肉鸡HSP70具有很好的免疫原性。以纯化的重组肉鸡HSP70免疫Balb/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。【结果】获得2株分泌肉鸡HSP70单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步通过免疫印迹分析筛选出1株高特异性的肉鸡HSP70单克隆抗体,命名为BH70-1。【结论】免疫组织化学结果显示,单克隆抗体BH70-1是一种理想的抗体。

异种HSP_(70)及固相抗体法体外扩增人γδT细胞的比较

目的 :比较异种HSP70 及固相抗体法体外扩增人γδT细胞。方法 :分别用固相抗体法、HSP70BCG 及小鼠榄香烯复合瘤苗热休克蛋白 70 肽复合物 (HSP70m 肽复合物 )体外扩增人PBMCs的γδT细胞 ,流式细胞仪检测细胞表型及亚型分布 ,RT PCR检测各亚型基因的取用。MTT检测γδT细胞的细胞毒作用。结果 :培养 14天后 ,抗体法扩增的PMBCs总数增加 30～ 4 0倍 ,γδT细胞的比率由 3.2 %提高到 86 .7% ;HSP70BCG 组PBMCs总数增加 7～ 8倍 ,γδT细胞的比率由 3.2 %提高到 71.32 % ;HSP70m 肽复合物组PBMCs总数增加 4～ 5倍 ,γδT细胞的比率由 3.2 %提高到 2 7.2 6 %。抗体及HSP70BCG 扩增的γδT细胞以表达Vγ9 Vδ2亚型为主 ,且Vδ1、Vδ2、Vδ3三种基因均得到取用 ,对Daudi具较高的杀伤活性。结论 :抗体及HSP70BCG 均能扩增出高纯度的γδT细胞 ,且具有完整的受体库 ,扩增的γδT细胞具细胞毒活性。

热应激蛋白70抗体滴度作为二硫化碳接触的生物标记物的研究

目的 :了解二硫化碳接触工人的血清热应激蛋白 70 (HSP 70 )抗体滴度及探讨其作为CS2 接触的分子生物标记物的可行性。方法 :选择某化纤厂 79名工人 ,5 4名为接触组 ,2 5名为对照组。用Westernblot ELISA法对工人血清HSP 70抗体水平进行了检测。采用Logistic回归分析技术 ,分析了HSP 70抗体与CS2 接触之间的关系。结果 :抗体各滴度接触组工人血清HSP 70抗体阳性率明显高于对照组 ,有非常显著意义 (P <0 .0 1)。采用Logistic回归分析控制了因素的混杂作用后 ,这种联系仍然存在。结论 :血清HSP 70抗体滴度可反映CS2 的接触状况。以血清HSP 70抗体滴度作为分子生物学标记物 ,对CS2 接触者进行健康监护有重要意义。

汕头市人群肠道病毒70型中和抗体调查

目的 观察近阶段人群中肠道病毒70型(EV -70 )感染状态。方法 采用中和试验测定人群中血清抗体。结果 EV -70中和抗体阳性率、抗体几何平均滴度(GMT)分别为45 .5 %、9.89,其中以7～14岁年龄组最高(5 9.1% ) ,3～6岁组次之(5 3 .3 % ) ,0～2岁组最低(3 1.8% )。GMT以5 1～90岁组最高(13 1 8) ,7～14岁组次之(12 4.8) ,0～2岁组最低(8.90 )。各年龄组抗体阳性率比较,差异有显著性(χ2 =9.891,P <0 0 5 ) ;男女阳性率比较,差异无显著性(χ2 =4.45 8,P >0 0 5 )。结论 反映人群受EV -70感染状态,EV -70在该地区人群中仍有一定程度的传播。

热休克蛋白70双向免疫印记鉴定及抗体制备

目的验证肺癌组织中热休克蛋白70(HSP 70)表达量,从肺癌组织中获得HSP 70并初步制备其人源性抗体,为进一步研究其生物功能和临床应用奠定基础。方法收集肺癌组织和癌旁组织标本,应用双向电泳-免疫印记方法验证HSP 70的表达量,经过亲和层析和离子交换层析方法获得肺癌组织中HSP 70作为抗原,经过四轮亲和-吸附-洗脱,从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中初步筛选其抗体。结果双向电泳-免疫印记结果表明,肺癌组织HSP 70表达量高于癌旁组织。凝胶电泳和免疫印记结果表明,从肺癌组织中获得了人源性HSP 70,以此HSP 70作为抗原,初步筛选出了其抗体。结论人源性HSP 70及其人源性特异结合抗体的获得,为进一步研究其抗肺癌的临床应用提供了基础依据。

二硫化碳接触工人热应激蛋白70及其抗体水平的变化

目的探讨二硫化碳诱导人体产生热应激蛋白70(HSP70)及其抗体水平情况。方法用免疫印迹法(Westemblot)和酶联免疫吸附(ELISA)法对职业性接触二硫化碳工人HSP70和HSP70抗体水平进行检测。结果接触组工人中血浆HSP 70抗体阳性率明显高于对照组(P<0.05),而HSP 70蛋白含量在两组间比较差异没有显著性(P>0.05);但据HSP 70抗体是否为阳性将工人分为阳性组和阴性组后,阳性组HSP 70蛋白含量低于阴性组,差异有显著性(P<0.05)。结论HSP 70及其抗体滴度可反映二硫化碳的接触状况,对接触二硫化碳作业工人的健康监护有一定意义。

热休克蛋白70抗体与慢性阻塞性肺疾病的关系

目的探讨热休克蛋白(HSP)70抗体与慢性阻塞性肺疾病(COPD)的关系。方法采用Western-ELISA方法检测了88例COPD与87例正常对照者血浆HSP70抗体,同时用免疫发光法检测血浆IgE的含量。结果在COPD与正常对照组中,HSP70抗体的阳性率分别为13.6%(12/88)和6.9%(6/87),两者之间差异无显著性意义(P>0.05);排除近1年使用过激素的COPD患者,未使用过激素的COPD患者HSP70抗体的阳性率为19.3%(11/57),与正常对照组之间差异有显著性意义(P<0.05)。另外,吸烟指数在HSP70抗体阳性和阴性两组之间分别为(768±485)和(798±493),差异无显著性意义(P>0.05);而IgE在两组分别为(252.8±458.7)和(73.9±131.5)U/ml,HSP70抗体阳性组明显高于HSP70抗体阴性组(P<0.05)。结论HSP70抗体可能在COPD的发病过程中起一定的作用,但尚需进一步研究并排除激素等干扰因素。

褶纹冠蚌(Cristaria plicata)热休克蛋白70的原核表达及多克隆抗体制备

构建褶纹冠蚌热休克蛋白70基因的原核表达质粒pET30a-cpHSP70,并经酶切和DAN测序鉴定。将其转入到表达宿主BL21(DE3)菌中,用IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western-blot检测。结果显示:新表达的重组蛋白分子量约为74kD。在IPTG的诱导下,其表达量随时间的增加而增加,最适表达条件是37℃诱导8h。表达蛋白可溶性分析发现,一部分蛋白以不溶性的包涵体形式存在,一部分蛋白以可溶性蛋白形式存在。Westernblot检测显示蚌在35℃热激诱导1h后,其血、鳃、肌肉、肝胰腺和外套膜组织cpHSP70蛋白表达水平相对于蚌在20℃暂养3h后的表达量明显升高。

系统性红斑狼疮患者抗HSP70和HSP60抗体的检测

目的:检测系统性红斑狼疮(SLE)患者抗热休克蛋白(HSP)70和HSP60抗体水平及与病情活动的关系。方法:采用Western印迹-酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测了60例SLE患者和45例正常对照组外周血抗HSP70、HSP60抗体水平和采用ELISA方法检测EB病毒抗体水平。结果:SLE活动期患者抗HSP70和HSP60抗体阳性率明显高于稳定期组,稳定期组的表达明显高于对照组;活动期的狼疮肾病患者抗HSP70抗体阳性率明显高于非狼疮肾病组;SLE患者中EB病毒感染阳性组抗HSP70和HSP60抗体阳性率均明显高于EB病毒感染阴性组。结论:抗HSP70和HSP60抗体可能在该病的发生与发展中起一定的作用。

Hsp70,Toll样受体4抗体与自身免疫性内耳病的关系

目的:建立一种自身免疫性内耳病的动物模型,寻求Toll样受体4抗体与Hsp70的关系.方法:提取豚鼠内耳膜迷路组织为抗原.将豚鼠用环磷酰胺预处理,将抗原与等量弗氏完全佐剂一起免疫豚鼠,观测Hsp70在内耳的表达;通过鼓室注射Toll样受体4抗体,再观测Hsp70在内耳的表达.结果:免疫豚鼠后听性脑干反应阈显著提高,内耳出现显著的炎细胞浸润,Hsp70的表达增强,TNF-α,NF-κB的表达增多,血清中检测到抗Hsp70抗体;加入Toll样受体4抗体后Hsp70的表达减弱,炎细胞减少,TNF-α,NF-κB的表达降低.结论:Toll样受体4抗体可下调Hsp70在自身免疫性内耳病中的表达.

冠心病患者血浆中抗热休克蛋白70抗体表达水平的研究

[目的 ]检测冠心病患者血浆中抗热休克蛋白 70 (HSP70 )抗体水平与正常人有无差异 ,并探讨其与冠心病发生发展之间的关系。 [方法 ]采用Western ELISA方法检测 192例冠心病患者中抗HSP70抗体水平 ,并以 192例无冠心病的个体作为对照。[结果 ] 192例冠心病患者中抗HSP70抗体阳性 7例 ,对照组 5例 ,病例组抗体阳性率与对照组之间差异无显著性 (P >0 .0 5 )。 [结论 ]本研究未发现抗HSP70抗体与冠心病的发生发展有联系 ,抗HSP70抗体在冠心病发病过程中的作用有待于进一步探讨。

CEA串连表位-HSP70融合基因疫苗诱导小鼠的表位特异性免疫应答

目的:观察癌胚抗原(CEA)串联表位-HSP70融合基因疫苗诱导的免疫应答,为开发新型肿瘤特异性基因疫苗奠定基础。方法:在已经构建含有变异热休克蛋白(HSP)序列的基础上,插入重组CEA串联表位的编码片段获得CEA串联表位-HSP融合基因疫苗。3次肌肉注射免疫Balb/c小鼠,设立注射生理盐水的阴性对照组、注射氢氧化铝佐剂混悬CEA串联表位的阳性对照组及注射pCITriCEA625-667-mtHSP70的实验组。FCM分析脾脏T细胞亚群;体外培养脾细胞,ELISA检测培养上清中干扰素γ(IFNγ)的相对含量;同时测定小鼠血清CEA特异性抗体的滴度。结果:阴性对照组脾细胞中CD3+和CD4+T细胞分别为55.1%±6.1%和30.2%±4.1%;实验组脾细胞中CD3+和CD4+T细胞分别为78.7%±9.2%和48.9%±4.7%,两组比较差异有显著性(P<0.01)。其体外特异性抗原肽诱导的IFNγ分泌处于本底水平,可视为生理性参数,体外非特异性和特异性的IFNγ分泌分别增加3和6倍(P<0.01)。血清中CEA表位特异性抗体滴度阴性对照组为0,阳性对照组<1:500,而融合基因疫苗免疫组达到1:4000。结论:CEA串联表位-HSP融合基因疫苗在体内诱导以激发辅助性T细胞为特征的免疫应答。

冷库工人血浆中HSP70抗体及脂质过氧化水平的研究

目的 研究低温作业人群中HSP70抗体水平及血浆中SOD、GSH、MDA等脂质过氧化指标水平,探讨低温作业对人可能的危害与机制。方法 选冷库作业工人为研究对象,其中保鲜冷库(0℃组) 5 3人,水产冷库(-2 0℃组) 5 3人,另选不从事有毒有害职业的村民5 7人作为对照。用Westernblot ELISA法研究血浆中热应激蛋白抗体表达水平,用试剂盒检测血浆中SOD、GSH、MDA等生化指标。结果 对照组5 7人中有3人出现血浆HSP70抗体1∶10阳性,阳性率为5 %;而0℃组5 3人中有14人阳性,占2 6%;-2 0℃组5 3人有11人出现阳性(2 .1%)。对照组1人出现1∶2 0阳性(2 %) ,0℃组有8人阳性,占15 %;-2 0℃组也有8人出现阳性(15 %)。0℃组与-2 0℃组分别与对照组相比,其血浆HSP70抗体水平明显增高,差异有显著性(P <0 .0 5 )。此外,0℃组与-2 0℃组中还各有1人出现1∶40阳性,而对照组没有检出。0℃组与-2 0℃组相比,HSP70抗体水平差异没有显著性(P >0 .0 5 )。对于各生化指标,0℃组与-2 0℃组分别与对照组相比,其血浆中SOD活性、GSH含量均下降,差异有显著性(P <0 . 0 5 )。而MDA含量增高(P <0 . 0 5 )。0℃组与-2 0℃组相比,各指标差异均无显著性。结论 在冷作业工人中存在着血浆中HSP70抗体水平的升高及脂质过氧化程度加重。

HSP70单克隆抗体的制备

利用DEAE 离子交换和ATP 亲和层析法从热休克的大鼠肝脏中分离纯化了热休克蛋白 70 (HSP70 )。用它做抗原免疫小鼠 ,通过分离脾淋巴细胞和细胞融合技术 ,得到了杂交瘤细胞 ;用酶联免疫吸附测定法筛选出了阳性克隆 ;经过多次亚克隆、抗体的大量制备及分离纯化 ,得到了抗HSP70的单克隆抗体。用此一抗和Western免疫印迹技术分析了C6 大鼠神经胶质瘤细胞中HSP70的表达。

σ^(70)因子抗体能特异性地识别其他转录因子

通过免疫印迹法研究了抗大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ７０因子的抗体对产气杆菌、金黄色葡萄球菌和不同生长阶段的天蓝色链霉菌细胞内蛋白质的免疫识别作用．结果表明，抗大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ７０因子抗体能特异性地识别上述微生物细胞内的一些蛋白质．对这些蛋白质的属性作了讨论，认为它们是ＲＮＡ聚合酶的转录因子．本研究还发现，抗大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ７０因子抗体识别的产气杆菌细胞内的蛋白质，在数量和种类上几乎完全与大肠杆菌相同．

B-CLL患者瘤细胞膜表面Id-ScFv和人Hsp70的制备及其抗瘤效应

背景与目的:恶性B型淋巴细胞表面免疫球蛋白(surface membrane immunoglobulin,SmIg)表达的独特型决定簇(Idiotypic determinant,Id)不仅是该类肿瘤特异性标记,也是该类肿瘤的特异性抗原,可诱导机体对其产生特异性免疫应答,但由于Id是自体成分,分子量小,免疫原性较弱。人热休克蛋白70(heat shock protein,Hsp70)是一类重要的抗原提呈分子,能有效加强抗原肽的免疫原性。本研究通过制备慢性B型淋巴细胞性白血病(B-cell chronic lymphatic leukemia,B-CLL)患者瘤细胞膜表面独特型单链抗体(Idiotypic determinant single-chain antibody,Id-ScFv)和Hsp70两种蛋白,在体外研究两者联合抗瘤作用并初步探讨其机制。方法:分别在大肠杆菌中表达Id-ScFv和Hsp70两种蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis)及ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay)检测鉴定后,分别用金属螯合层析和离子交换层析纯化并在体外将这两种蛋白结合成复合物(Hsp70-Id)。用MTT法及检测Id-ScFv组、人Hsp70组及Hsp70-Id组刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的增殖作用,以ELISA法检测各组培养上清中IL-12和TNF-α水平,并用流式细胞术检测各组PBMC亚群的变化。用活细胞计数法检测各组被激活的PBMC对慢性B细胞白血病细胞株Daudi、慢性髓性白血病细胞株K562和肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果:经SDS-PAGE电泳分析纯化后表达产物的分子量大约为30ku(Id-ScFv蛋白)和70ku(Hsp70蛋白),分别与其理论预期值相符。PBMC的增殖作用、培养上清中IL-12和TNF-琢水平,Hsp70-Id组明显强于Id-ScFv组和人Hsp70组(P<0.05),而Id-ScFv组和人Hsp70组明显强于阴性对照组(P<0.05)。流式细胞术检测显示在Hsp70-Id组、Id-ScFv组和人Hsp70组PBMC中CD8+T细胞亚群的百分率均有增加,其中Hsp70-Id组最明显。在Id-ScFv组和Hsp70-Id组激活的PBMC对Daudi细胞的杀伤作用较K562、HepG2细胞强(P<0.05),且Hsp70-Id组激活的PBMC对Daudi细胞的杀伤作用明显强于Id-ScFv组(P<0.001)。结论:成功获取B-CLL患者瘤细胞膜表面Id-ScFv和人Hsp70两种纯化蛋白;Hsp70-Id在体外可增强PBMC的特异性杀瘤作用,其机制可能与促进PBMC的增殖、活化CD8+T细胞并诱导具有抗肿瘤作用的Th1型细胞因子的分泌有关。

2型糖尿病患者外周血浆中热休克蛋白70抗体的变化

目的:探讨2型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)患者外周血浆中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)抗体与其病情发生发展的关系。方法:选择112例确诊T2DM的患者(T2DM组),同时选择110例非T2DM的健康体检者(对照组)。采用蛋白质免疫印迹-酶联免疫吸附法(Western blot-ELISA)检测两组患者血浆中HSP70抗体的水平。采用非条件Logistic回归分析HSP70抗体与T2DM的关系。结果:T2DM组中血浆HSP70抗体阳性者36例,对照组则为9例;两组的HSP70抗体阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归显示,HSP70抗体是T2DM的独立危险因素。结论:HSP70抗体可能是T2DM发生发展的独立危险因素。