大黄鱼β-actin抗体的制备与组织表达谱分析

为探讨大黄鱼(Larimichthys crocea)β-actin基因(Lc Actb)作为内参基因进行相关研究的可行性,从转录和翻译水平研究其组织表达谱,作者以大黄鱼肝脏为材料,扩增Lc Actb的开放阅读框序列,并将其亚克隆至原核表达载体p ET32a(+)。酶切、测序结果表明,p ET32a-Lc Actb构建成功。将p ET32a-Lc Actb转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blotting验证;原核表达结果表明,IPTG可诱导一个分子量约45 ku的特异蛋白,且主要以包涵体的形式存在,优化表达条件为:28℃、0.4mmol/L IPTG、200 r/min诱导表达5 h。用表达蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔制备抗Lc Actb的多克隆抗体;用纯化的多抗进行Western blotting的结果表明,获得了特异性的Lc Actb抗体;通过实时荧光定量RT-PCR检测大黄鱼多种组织m RNA的表达,其次,制备了多种组织匀浆蛋白,使用纯化的抗体进行Western blotting分析,结果显示,Lc Actb在大黄鱼成体各组织中转录和翻译水平的表达差异均不显著,可做为研究大黄鱼成体组织中其他基因表达和翻译水平的内参标准。

棉铃虫β-actin基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

克隆获得了棉铃虫β-actin基因,生物信息学分析表明,基因序列长1 131 bp,编码376个氨基酸,理论分子量为41.77 k D,理论等电点5.16。氨基酸序列与其他物种肌动蛋白比较有98%-99%的一致性,与鳞翅目的家蚕具有99%的一致性。分析棉铃虫β-actin和小家鼠β-actin的抗原决定簇位点,发现两者抗原表位有70.63%的一致性。同时原核表达、纯化了棉铃虫β-actin蛋白,Western-blot结果表明表达正确。将纯化后的蛋白免疫ICR小鼠4次后,小鼠抗血清效价最高可达388 800,并且能与天然棉铃虫蛋白特异性结合。

玉米ZmGAPDH和ZmACTIN的原核表达及抗体制备

【目的】制备玉米三磷酸甘油醛(GAPDH)和肌动球蛋白(ACTIN)的多克隆抗体,检测热激条件下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN的表达,为将ZmGAPDH和ZmACTIN作为非生物胁迫下的内参基因奠定基础。【方法】利用DNAMAN 7对ZmGAPDH和ZmACTIN与不同植物同源蛋白间的氨基酸序列进行比对。通过PCR克隆ZmGAPDH和ZmACTIN的CDS,将其构建到原核表达载体pET-28a中并测序;将重组质粒载体转化大肠杆菌BL21(DE3)和RG2,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;将目的蛋白透析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。利用RT-PCR和Western blot检测42℃热激不同时间(0,2,4,8 h)下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN mRNA及其蛋白的表达水平。【结果】克隆了ZmGAPDH和ZmACTIN基因的CDS序列,成功构建了原核表达载体pET-28a-ZmGAPDH和pET-28a-ZmACTIN。在大肠杆菌中表达出了玉米ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白,将纯化的蛋白免疫家兔后获得了多抗血清。ZmGAPDH多克隆抗体能清晰检测到4 ng原核表达的ZmGAPDH抗原,ZmACTIN多克隆抗体同样能够清晰检测到4 ng原核表达的ZmACTIN抗原。热激不同时间下玉米B73叶片中的ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白表达水平一致,mRNA丰度稳定不变。【结论】成功制备了ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白多克隆抗体;ZmGAPDH和ZmACTIN可以作为内参基因,用于检测热激条件下目标基因的表达水平。

草地贪夜蛾β-Actin基因的原核表达及多克隆抗体制备

草地贪夜蛾是一种重要的农业害虫,其迁飞性强、寄主广、繁殖力高,给我国农业经济带来了严重损失。从分子水平探究草地贪夜蛾生长、发育、繁殖、抗药性形成的内在分子机理,能为虫害的防治、防控提供重要参考。β-Actin作为一种高度保守的看家蛋白常在分子生物学中用作内参去定量目标蛋白的表达水平,因而获得高质量的β-Actin抗体是从事相关分子研究的基本前提。因此,本研究克隆了草地贪夜蛾β-Actin基因部分编码序列,长度为579 bp。利用原核表达系统诱导获得了约37 kD的β-Actin重组蛋白,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备得到β-Actin多克隆抗体血清。经ELISA检测,获得的抗血清效价达1∶256000。利用制备的β-Actin抗血清进行Western blot试验,结果显示在42 kD处出现强且单一的蛋白条带,说明制备的β-Actin抗血清能有效识别草地贪夜蛾β-Actin蛋白。综上,本研究制备的β-Actin多克隆抗体效价高、特异性较强,能为草地贪夜蛾后续相关分子研究提供基本条件。

弓形虫肌动蛋白抗原表位抗体的制备及应用

制备弓形虫肌动蛋白(TgActin)多肽表位抗体并探讨其应用价值。BepiPred 1.0 Server在线分析设计TgActin抗原表位,并与多种属Actin进行同源比对,选取并合成高特异性多肽片段序列免疫新西兰兔。末次免疫后收集兔血清并使用Protein G纯化抗体,SDS-PAGE检测抗体纯度,ELISA测定抗体效价,Western blot分析抗体的特异性及TgActin表位抗体作为内参抗体的可能性,免疫荧光观察胞内速殖子形态。结果显示,ELISA测定抗体效价为1∶128000,Western blot结果显示抗体特异性识别弓形虫Actin,免疫荧光染色显示TgActin表位抗体可以标记纳虫泡内速殖子。结果表明,成功制备了TgActin多肽表位抗体,可用做弓形虫蛋白检测的内参抗体及其在细胞内的免疫荧光检测,为后续弓形虫研究提供了便利条件。

抗肌动蛋白单克隆抗体在早期心肌缺血诊断中的应用

应用抗肌动蛋白单克隆抗体（HHF35），对10例正常心肌、6例已知心肌梗死、18例可疑早期心肌缺血组织进行石蜡切片免疫组化染色。结果：正常心肌阳性，梗死心肌阴性，18例可疑病例中14例呈不同程度弱阳性或阴性。表明心肌发生了缺血性改变，对比清晰，特异性强，对心肌缺血诊断有明显的应用价值。

大鼠心肌缺血再灌流损伤的免疫组化研究

用16只 SD 大白鼠建立缺血再灌流心肌损伤模型,其中8只预先静脉注射吗啡以抗心律失常。此外,再用8只大鼠开胸作正常对照。其心脏标本进行 HE 染色及抗肌动蛋白单克隆抗体(HHF_(35))免疫组化观察:对照组心肌呈均匀一致的棕褐色染色;注射吗啡后再灌流组心肌呈小灶性分布的 HHF_(35)染色缺染区;未注射吗啡组心肌缺染呈广泛大面积分布。结果表明,HHF_(35)免疫组化法对显示实验性心肌缺血再灌流损伤有重要价值,且心肌缺血再灌流损伤程度与心律失常有关。

抗纤维肌动蛋白抗体对自身免疫性肝炎Ⅰ型的诊断价值

目的探讨抗纤维肌动蛋白抗体（AFA）对自身免疫性肝炎（AIH）Ⅰ型的诊断价值。方法收集163例AIH-Ⅰ型、5例AIH-Ⅱ型、26例AIH-Ⅲ型、26例原发性胆汁性肝硬化（PBC）、5例原发性硬化性胆管炎（PSC）、2例重叠综合征（AIDOS）及95例其他类型肝病患者的临床资料,另外收集197例健康献血者作为对照组,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）分别检测上述标本的AFA和抗平滑肌抗体（ASMA）,对检测结果进行统计分析。结果以浓度≥30 U/L为阳性标准判断,AFA与ASMA检测AIH-Ⅰ型患者的阳性率无统计学差异（χ^2=0.37,P=0.54）,但ASMA检测AIH-Ⅲ型和乙型肝炎患者的阳性率高于AFA,差异有统计学意义（χ^2值分别为5.65、6.37,P值分别为0.02、0.01）。AFA对ASMA≥20 U/L的AIH患者检出率≥98.27%,检测结果与ASMA的浓度有显著相关性（r=0.88,95%CI：0.66-0.99,P=0.00）。AFA与ASMA检测AIH-Ⅰ型患者的敏感性相近（71.78%vs68.71%）,但AFA的特异性（83.87%vs 54.84%）和Youden指数（0.56 vs 0.24）更高。结论与ASMA相比,AFA检测AIH-Ⅰ型患者敏感性相近,但特异性和Youden指数更高,AFA对AIH-Ⅰ型的诊断价值优于ASMA。

酶联免疫法检测自身免疫性肝炎I型抗纤维肌动蛋白抗体的评估

目的对使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)Ⅰ型患者抗纤维肌动蛋白抗体(AFA)进行评估分析。方法收集163例AIH-Ⅰ型、15例AIH-Ⅱ型、36例AIH-Ⅲ型患者临床资料及血清标本,采用ELISA法检测患者的AFA,同时采用间接免疫荧光法(IFA)检测患者的AFA和抗平滑肌抗体(ASMA)作为对照,对检测结果进行统计学分析。结果以IFA≥1∶320、ELISA≥30 U为阳性判断标准,除AFA-ELISA与ASMA-IFA检测AIH-Ⅱ型的阳性例数差异有统计学意义外(P=0.03),AFA-ELISA与AFA-IFA、ASMA-IFA比较,检测其他AIH各型患者阳性例数差异均无统计学意义(P﹥0.05)。AFAELISA与AFA-IFA检测AIH-Ⅰ型的相关性比ASMA-IFA更好(r=0.97 vs 0.52)。AFA-ELISA与AFA-IFA相比,检测AIH-Ⅰ型有稍高的敏感性(76.07%vs 71.17%)和略低的特异性(72.55%vs 78.43%);AFA-ELISA与ASMA-IFA相比,检测AIH-Ⅰ型有更高的敏感性和特异性(76.07%vs 64.42%,72.55%vs 60.78%);AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的约登指数与AFA-IFA相近(0.49 vs 0.50),比ASMA-IFA高(0.49 vs 0.25)。AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的ROC面积为0.86,当浓度为54.06 U/ml时检测的敏感性和特异性最好。结论 AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的敏感性和特异性与AFA-IFA相近,但操作更方便,与ASMA-IFA的敏感性相近,但特异性更好。AFA-ELISA可作为AIH-Ⅰ型较好的筛查方法。

主动免疫肌动蛋白样蛋白7a蛋白引起小鼠睾丸曲细精管的损伤

目的原核表达并纯化全长的人精子肌动蛋白样蛋白7a(ACTL7a)蛋白,检测主动免疫ACTL7a产生抗精子抗体后小鼠睾丸的损伤情况。方法构建重组表达质粒pET30a-ACTL7a,以重组质粒转化E.coli Rosseta(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过镍离子金属螯合树脂纯化和SDS-PAGE切胶分离目的蛋白,溶胶后以表达的ACTL7a蛋白免疫ICR小鼠。ELISA检测抗体效价,PAS染色检测主动免疫后曲细精管的发育。结果经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达出目的蛋白ACTL7a,纯化后免疫ICR小鼠,经PAS染色发现主动免疫ACTL7a的小鼠其睾丸曲细精管出现生精细胞脱落、核凝聚、生精细胞缺如、生精细胞退化等异常的管腔。结论成功构建了ACTL7a基因全长的原核表达载体,经诱导表达和纯化获得高纯度的目的蛋白。发现ACTL7a蛋白主动免疫ICR小鼠产生抗精子抗体后,小鼠睾丸的曲细精管发生严重损伤。

抗纤维肌动蛋白抗体阴性的自身免疫性肝炎Ⅰ型患者临床特征分析

目的探讨抗纤维肌动蛋白抗体(AFA)阴性的自身免疫性肝炎(AIH)I型患者的临床特点。方法收集194例AIH-I型患者临床资料,按照检测结果将患者分为AFA阳性组124例和AFA阴性组70例,另外收集197例健康献血者作为对照组。采用ELSIA法检测AIH-I型患者AFA、抗肝肾微粒体I型抗体(LKM-1)、抗可溶性肝抗原/胰抗原抗体(SLA/LP)、抗肝细胞溶质抗原I型抗体(LC-1),间接免疫荧光法检测抗核抗体(ANA)、抗平滑肌抗体(ASMA)。对AIH-I型患者作肝脏病理组织学检查和生化检测。统计学处理采用t检验、秩和检验和χ2检验。结果 AIH-I型患者中AFA阴性与阳性的男女人数和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),自身抗体ANA、ASMA、LKM-1、SLA/LP和LC-1检出率差异也无统计学意义(P>0.05),但AFA阴性比阳性患者的急性发病人数百分率高(34.29%比12.90%,P<0.01),血清ALT高[(146.32±20.87)U/L比(128.26±38.09)U/L,P=0.008]、AST高[(124.55±23.54)U/L比(97.62±45.26)U/L,P=0.004]、胆红素高[(42.57±14.17)μmol/L比(29.73±10.17)μmol/L,P=0.001]、免疫球蛋白G低[(18.42±5.11)g/L比(26.36±6.92)g/L,P<0.01]。肝组织病理检测可见AFA阴性比阳性患者的浆细胞浸润率高(35.71%比21.77%,P=0.03)、中央肝小叶3区坏死率高(41.43%比11.29%,P<0.01)。结论AIH-I型患者中AFA阴性比阳性患者的急性发病率高,血胆红素、ALT和AST升高,免疫球蛋白G降低,肝组织浆细胞浸润率、肝小叶3区坏死率升高。

大鼠心肌缺血再灌流损伤的免疫组化研究

以16只SD大白鼠建立缺血再灌流心肌损伤模型,其中8只预先作静脉注射吗啡以抗心律失常,再以8只大鼠开胸作正常对照。心脏标本进行HE染色及抗肌动蛋白单克隆抗体(HHF35)免疫组化观察。结果发现,对照组心肌呈均匀一致棕褐色阳性显色,而用吗啡后再灌流组心肌HHF35染色缺染区呈小灶性分布;非用吗啡组心肌缺染呈广泛大面积分布。HE染色未见明显改变。表明HHF35免疫组化法对显示实验性心肌缺血再灌流损害有重要价值,同时说明心肌缺血再灌流损伤程度与心律失常有关。

乳鼠脑血管平滑肌细胞的分离培养与鉴定

目的建立一种快速、简单、高效的脑血管平滑肌细胞分离和培养方法,对脑血管疾病机制的研究提供实验材料基础。方法用不含EDTA胰蛋白酶消化组织获取细胞,继而于倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况,对第3代细胞采用α-肌动蛋白荧光免疫染色法,同时MTT检测细胞的生长趋势。结果运用胰酶消化法获得并培养出大量的脑血管平滑肌细胞,荧光免疫染色法鉴定结果显示阳性表达,纯度98%。结论此方法简单、操作性强,目标细胞获得率高,为老年性脑血管疾病机制研究提供材料支持。

胞外肌动蛋白检测的临床应用

肌动蛋白是细胞骨架微丝系统的主要组成成分,在细胞膜完整性受损的情况下,肌动蛋白被释放到细胞外成为危险相关分子模式的一员。目前已发现的胞外肌动蛋白有三种存在形式:与细胞膜外表面连接、存在于细胞外基质或是游离于循环体液中。胞外肌动蛋白参与多种疾病病理生理过程,作为一种自身抗原也参与许多自身免疫性疾病的发生发展。循环游离肌动蛋白、抗肌动蛋白免疫球蛋白以及肌动蛋白清除系统相关组分均可以作为生物标志物,用于多种疾病的预后判断。

蓖麻肌动蛋白基因的克隆、抗体制备和表达分析

为探讨蓖麻肌动蛋白(Actin)基因(RcActin)是否可作为蓖麻基因表达研究中的内参基因。以蓖麻生长根为试验材料,根据GenBank中公布的RcActin全长cDNA序列(登录号:XM002522148.3)设计合成特异性引物,经PCR扩增获得RcActin的编码序列(CDS),并将其插入原核表达载体pET32a(+)中。重组表达载体pET32a(+)-RcActin转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合6个组氨酸标签的目的蛋白,表达蛋白经钴离子螯合磁珠纯化后,采用Western Blot验证,结果表明,pET32a(+)-RcActin可诱导表达分子量约为61.46 ku的融合蛋白His-RcActin。用纯化的His-RcActin免疫BALB/c小鼠,经细胞融合及筛选获得9株能分泌抗蓖麻RcActin蛋白质单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)的杂交瘤细胞株。利用阳性杂交瘤细胞株刺激小鼠,取腹水,采用间接ELISA方法测定,结果表明,5株阳性单克隆细胞株腹水效价达到1∶1 000 000及以上。用蛋白A/G亲和层析法纯化His-RcActin McAb;采用间接ELISA方法对纯化McAb的特异性进行测定,3株阳性细胞株能分泌针对RcActin的特异性McAb;通过抗体亚类鉴定试剂盒鉴定纯化McAb的亚型,结果表明,3株阳性细胞株分泌的McAb亚类均为IgG1。采用间接ELISA方法对3株阳性细胞株分泌McAb的稳定性进行鉴定,获得1株在体外传19代或液氮冻存4个月后、能稳定分泌McAb的阳性细胞株。采用Western Blot和间接ELISA方法对从该细胞株中纯化的McAb的特异性、效价进行验证,结果表明,获得的McAb具有针对RcActin的特异性且效价为1∶512 000。以制备的McAb为一抗,利用Western Blot方法分析RcActin在正常水肥管理且时空一致条件下的蓖麻8个组织中的表达量,结果表明,蓖麻不同组织中RcActin的含量存在显著性差异(P<0.05)。RT-qPCR分析结果表明,蓖麻不同组织中RcActin mRNA也存在显著性差异(P<0.05)。通过Western Blot方法分析RcActin在不同浓度NaCl胁迫下盆栽蓖麻根系中的表达量;通过RT-qPCR对不同组织中RcActin mRNA表达量进行分析,结果表明,蓖麻不同组织中RcActin蛋白质和RcActin mRNA的表达量均存在显著性差异(P<0.05)。RcActin表达研究为蓖麻功能基因表达分析中内参基因的筛选提供了一定的理论依据。

家蚕常用内参蛋白多克隆抗体的制备及应用比较分析

内参基因是一种在所有组织和细胞中都表达的管家基因,常被用作基因和蛋白质功能研究中的参照。目前市场上商品化的内参抗体在家蚕中检测不稳定,制备高效、特异的可用于家蚕研究的内参抗体显得十分必要。对家蚕中常用的内参基因actin和tubulin进行克隆,构建其原核表达载体;通过原核表达和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白;免疫新西兰大白兔后,成功制备了二者的多克隆抗体;酶联免疫吸附检测Actin抗体和Tubulin抗体的效价分别为1∶1000和1∶16000。Western blot结果表明,制备的家蚕内参抗体不仅能特异结合家蚕蛋白,同时可有效检测其他昆虫及哺乳动物中的相应蛋白,且抗体制备简单,成本较低,从而增加了内参抗体的多样性和选择性,为后续家蚕蛋白的功能研究奠定了基础。

洋葱鳞茎中肌球蛋白和肌动蛋白的免疫化学鉴定

制备了粘菌肌动蛋白抗血清和鸡骨骼肌肌球蛋白抗血清。用这两种抗血清,经对流免疫电泳,火箭电泳及酶联免疫吸附分析,证明了高等植物洋葱鳞茎中肌球蛋白和肌动蛋白的存在。

弓形虫actin蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的制备弓形虫肌动蛋白(actin)的多克隆抗体并纯化。方法以弓形虫cDNA链为模板PCR扩增1 131bp actin基因,亚克隆至pET30a载体后转化入大肠埃希菌BL21中,用1mmol/L IPTG诱导表达actin-His6蛋白,采用亲和层析法纯化;取200μg纯化蛋白加等量佐剂混合,免疫SD大鼠4次,收集抗血清,用亲和纯化柱纯化。结果 PCR扩增出actin基因并成功构建actin/pET30a/BL21表达系统,获得actin-His6蛋白,制备的大鼠源性actin-His6蛋白多克隆抗体纯化后为单一蛋白抗体。结论制备并纯化了抗弓形虫actin的多克隆抗体,为弓形虫入侵机制的研究奠定了基础。

联合抗核抗体和抗纤维肌动蛋白抗体对自身免疫性肝炎I型的诊断价值

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）I型是一种慢性进行性肝脏疾病，免疫抑制剂能有效控制部分AIH—I型患者病情的发展，但如果不能正确诊断、及时治疗，患者可能最终导致肝硬化和肝功能衰竭。因此，寻找敏感性和特异性高的AIH—I型诊断指标对患者很重要。

大黄素抑制IgG型抗双链DNA抗体诱导的系膜细胞表型转化的研究

目的探讨大黄素对IgG型抗双链DNA(dsDNA)抗体诱导的大鼠系膜细胞(MCs)表型转化的抑制作用。方法利用马疫锥虫动基体DNA诱导大鼠产生IgG型抗dsDNA抗体,小牛胸腺DNA纤维素层析法提纯抗体。体外培养正常MCs(空白组),或在培养上清中分别加入IgG型抗dsDNA抗体、25 mg/L大黄素(对照组),或同时加IgG型抗dsDNA抗体与大黄素(实验组),检测MCs合成转化生长因子-β_1(TGF-β_1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等水平,并在透视电镜下观察细胞显微结构的变化。结果与空白组比较,抗体对照组合成TGF-β_1等水平明显升高(P<0.05),并出现肌成纤维细胞样结构变化;而大黄素对照组的上述指标下降(P<0.05),且细胞显微结构基本正常。与抗体对照组比较,实验组合成TGF-β_1等水平降低,细胞显微结构大致正常。结论抑制IgG型抗dsDNA抗体诱导的系膜细胞表型转化可能是大黄素治疗狼疮肾炎的药理机制之一。