从海马区胶质细胞CD137L途径探讨电针治疗神经痛的作用机制

目的:探讨海马CA1区胶质细胞CD137L在电针改善神经痛大鼠机械痛及学习记忆障碍的作用机制。方法:将24只SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组和电针组,每组8只。模型组和电针组制备坐骨神经分支选择性损伤(SNI)神经痛模型;假手术组只暴露坐骨神经,但不结扎。造模后第7天开始,电针组对右侧环跳、阳陵泉穴予以电针刺激,频率2 Hz,强度1 mA,每天1次,每次30 min,连续21 d;假手术组和模型组同等条件抓取、固定,但不进行任何干预。SD大鼠造模前及造模后第28天,用Von-Frey测痛仪检测机械痛阈值;造模后28 d采用新物体识别实验检测大鼠学习记忆能力;酶联免疫吸附法检测海马CA1区CD137L、胶质细胞活化标记物(Iba-1、GFAP)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度;免疫荧光组织化学法检测海马CA1区CD137L及其受体CD137在神经细胞的表达定位情况。结果:①与假手术组比较,模型组机械痛阈值和新物体识别指数均显著降低(P<0.01);与模型组比较,电针组机械痛阈值和新物体识别指数均显著升高(P<0.01)。②与假手术组比较,模型组海马CD137L、Iba-1、GFAP和TNF-α浓度均显著升高(P<0.01),Iba-1和GFAP免疫反应阳性个数明显增多(P均<0.01);与模型组比较,电针组海马CD137L、Iba-1、GFAP和TNF-α浓度均显著下降(P均<0.05),Iba-1和GFAP免疫反应阳性个数均明显减少(P<0.01)。③免疫荧光检测发现,海马CA1区CD137L及其受体CD137与Iba-1、GFAP共表达明显,提示CD137L及其受体CD137主要表达于小胶质细胞、星形胶质细胞,但不表达于神经元。结论:电针可能下调海马CA1区胶质细胞CD137L表达,抑制胶质细胞的活化和TNF-α的释放,减轻神经痛大鼠疼痛及学习记忆障碍。

CD137L,a driver of harmful inflammation in the nervous system

CD137 (TNFRSF9,4-1BB) is a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor family and a potent costimulatory molecule.High levels of CD137 are expressed on T cells upon activation.CD137 signaling in T cells,either by cognate interaction with antigen-presenting cells (APC)or by agonistic anti-CD137 antibodies,strongly enhances proliferation,interferon-y secretion,and cytolytic activity of T cells.Thus,CD137 signaling is a main driver of cellular,type 1 helper T cells (Th1)and type 1 cytolytic T cells (Tc1) polarised immune responses.

hTERT启动子调控下CD137L表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的研究hTERT启动子调控下CD137L表达载体的构建及其在人卵巢癌细胞系中的表达,探讨CD137L靶向基因治疗的可行性。方法采用RT-PCR法从K562细胞中克隆CD137L全长基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建的质粒为pcDNA3-hCD137L,用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后将CD137L再定向插入pBTdel-279中,构建成hTERT启动子调控下CD137L表达载体pBTdel-279-hCD137L,采用酶切法和测序法鉴定。用Fugene6转染试剂盒将两种重组质粒分别瞬时转染人卵巢癌细胞株OVCR3和人胚肺成纤维细胞株HELF,RT-PCR和流式细胞仪检测CD137L的表达。结果测序证实所克隆的CD137L基因序列与GENE-BANK中的序列相符。经限制性内切酶酶切,电泳后显示片段插入正确,证实构建成功。pcDNA3-hCD137L转染后OVCR3细胞和HELF细胞均可检测到CD137L的表达,但pBTdel-279-hCD137L转染后仅在OVCR3细胞中检测到其表达,在HELF细胞中无表达。流式细胞显示pBTdel-279-hCD137L转染效率低于pcDNA3-hCD137L。结论hTERT启动子调控下CD137L表达载体构建正确,并可在卵巢癌细胞中较高表达,为探讨靶向基因治疗提供了实验依据,但hTERT启动子活性仍低于CMV启动子。

ABS-ELISA检测46例结直肠癌患者血清可溶性CD137L浓度

目的建立一种灵敏、可靠的检测血清可溶性CD137L(sCD137L)浓度的方法。方法建立链霉亲和素-生物素-ELISA检测27例结肠癌患者、19例直肠癌患者以及15例健康对照者血清sCD137L水平。结果46例结直肠癌患者血清sCD137L的平均浓度为(1091.48±519.32)pg/ml,显著高于健康对照组[(4.36±2.94)pg/ml](P<0.01)。结论结直肠癌患者血清sCD137L水平显著升高,血清sCD137L浓度在结直肠癌的诊断及疗效评估、预后判断中可能具有一定的临床价值。

CD137L在非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭中的作用及机制

目的研究CD137L在非小细胞肺癌中的表达,及其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响,探讨其可能的分子生物学机制。方法通过体外构建CD137L高表达慢病毒载体[A549-TC-1(+)]及CD137L-RNA干涉慢病毒载体[A549-TC-1(-)]和空白载体(A549-control),分别转染肺癌A549细胞。采用Western blot检测3组细胞CD137L蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖情况;Matrigel transwell小室侵袭实验研究肺癌细胞侵袭能力;ELISA方法检测细胞上清IL-6和IL-8的水平。结果 Western blot结果显示:与A549细胞相比,CD137L蛋白在A549-TC-1(+)细胞中表达明显增多,A549-TC-1(-)细胞中表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),在转染A549-control中无明显变化,表明3种病毒载体可用于后续实验。MTT细胞增殖实验及Matrigel Transwell小室侵袭实验结果显示:与A549-control相比,A549-TC-1(+)细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显增强,A549-TC-1(-)细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显减弱,差异均有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测结果显示:A549-TC-1(+)细胞中细胞因子IL-6、IL-8的水平明显高于A549-TC-1(-)细胞组和正常A549细胞组。结论 CD137L对非小细胞癌细胞的增殖、侵袭具有正性调节功能,其作用机制可能与促进IL-6、IL-8的分泌进而增强肿瘤的生长、增殖和侵袭能力有关。

CD137-CD137L信号通过CaM-CaN通路调控小鼠血管平滑肌细胞NFATc1表达

目的:探讨CD137-CD137L信号是否通过钙调蛋白-钙调神经磷酸酶(Calmodlin-Calcineurin,CaM-CaN)通路调控小鼠血管平滑肌细胞活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)的表达。方法:采用改良组织贴块法原代培养小鼠血管平滑肌细胞。实验分两部分,第一部分细胞分组:对照组、CD137刺激组(激动型CD137抗体10μg/m L)和CD137抑制组(抑制型CD137抗体10μg/m L预孵30 min后+激动型CD137抗体10μg/m L);第2部分细胞分组:对照组、CD137刺激组(激动型CD137抗体10μg/m L)、si CaM组(si-CaM+CD137刺激组)和si CaN组(si-CaN+CD137刺激组)。分别采用蛋白质印迹和RT-PCR检测平滑肌细胞CaM、CaN及NFATc1的蛋白和mRNA表达水平。结果:(1)蛋白质印迹和RT-PCR结果显示,与对照组相比,CD137刺激组小鼠平滑肌细胞CaM、CaN及NFATc1表达明显升高(P<0.05);与CD137刺激组相比,CD137抑制组CaM、CaN及NFATc1表达显著降低(P<0.05)。(2)通过si-RNA技术分别沉默CaM和CaN后,与CD137刺激组相比,si CaM组CaM、CaN及NFATc1表达水平明显降低(P<0.05);si CaN组的CaM无明显改变(P>0.05),而CaN及NFATc1表达明显降低(P<0.05)。结论:CD137-CD137L信号可能通过CaM-CaN通路调控NFATc1的表达。

CD137L在食管癌的表达及其临床病理学意义

目的检测CD137Lm RNA和蛋白在食管癌及癌旁组织中的表达,研究CD137L的表达水平与食管癌的临床病理特征、预后等临床参数之间的关系。方法应用免疫组织化学染色法及实时荧光定量PCR检测食管癌组织和癌旁正常食管黏膜组织中CD137L的表达。结果 CD137L在61例食管癌中的表达率是52.5%(32/61),在30例癌旁组织中CD137L蛋白的表达为阴性,CD137L在食管癌组织的表达与患者的年龄、性别及是否有淋巴结转移等无明显相关性(P>0.05),与鳞状细胞癌的分化程度(P=0.001)及临床分期相关(P=0.048)。18例食管癌组织中CD137Lm RNA的相对表达水平为0.075±0.355,显著高于癌旁组织的0.031±0.383(P<0.05)。结论 CD137L表达在食管癌细胞膜和细胞质,CD137Lm RNA在食管癌组织中高表达,提示CD137L在食管癌发展过程中起到非常重要的作用。

CD137L、VEGF和E-cad在食管鳞癌组织中的表达及其与淋巴结转移、预后的相关性

目的探讨人CD137配体(CD137L)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)在食管鳞癌组织中的表达及与淋巴结转移、预后的相关性。方法免疫组化检测95例食管鳞癌组织和对应癌旁组织中CD137L、VEGF和E-cad表达,分析CD137L、VEGF和E-cad表达与临床病理特征的关系,随访患者生存情况,分析CD137L、VEGF和E-cad与生存预后的关系。结果CD137L和E-cad主要表达在细胞膜或少量细胞质,VEGF在食管癌组织中表达于胞质,食管癌组织CD137L和E-cad阳性率低于癌旁组织,VEGF表达阳性率高于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、肿瘤最大径<5 cm、浸润深度T1-T2食管癌患者CD137L阳性表达率显著高于TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、肿瘤最大径≥5 cm、浸润深度T3-T4患者(P<0.05);TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移、肿瘤最大径≥5 cm食管癌患者VEGF阳性表达率显著高于TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移、肿瘤最大径<5 cm患者(P<0.05);TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移、中高分化食管癌患者E-cad阳性表达率显著高于TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移、低分化患者(P<0.05)。CD137L、E-cad阳性表达的食管癌患者生存期长于阴性表达患者(χ^(2)=17.980、7.197,均P<0.05);VEGF阳性表达的食管癌患者生存期短于阴性表达患者(χ^(2)=17.940,P<0.001)。COX回归分析发现,TNM分期、淋巴结转移、VEGF阳性表达是食管癌预后的危险因素,HR值分别为3.394、2.803、3.019,CD137L、E-cad阳性表达则是食管癌预后的保护因素。结论CD137L、VEGF和E-cad在食管鳞癌组织中存在差异表达,且与淋巴结转移和预后密切相关。

CD137/CD137L在抗感染免疫中的作用

CD137/CD137L是一种T细胞共刺激分子,近些年的研究表明它们在细菌、病毒等抗感染免疫方面起重要作用。文章就CD137/CD137L的结构和功能、以及其在抗感染性疾病的研究进展作一综述。

CD137L分子在人肺癌细胞系A549上的表达及其生物学功能的研究

目的研究共刺激分子CD137L分子在人肺癌细胞系A549上的表达及其生物学功能。方法流式细胞术(FACS)和RT-PCR方法检测CD137L分子在A549上的表达。采用CD137-Fc融合蛋白刺激A549上的CD137L分子,ELISA实验分析细胞因子的分泌。结果FACS实验结果显示CD137L分子表达在A549上,RT-PCR实验结果进一步证实了上述发现。ELISA实验结果显示,CD137-Fc可刺激A549 IL-8的分泌。结论A549表面CD137L分子在蛋白分子水平和mRNA水平均有表达;并可发挥调节IL-8分泌的功能。

CD137L在急性髓细胞白血病中的突变表达及临床意义

目的检测CD137L在急性髓细胞白血病细胞系及临床患者中的突变表达,为临床急性髓细胞白血病的诊断和治疗提供依据。方法设计引物建立sCD137L突变检测方法,采用RT-PCR检测THP-1细胞CD137L的表达;收集临床AML病例,经Ficoll分离后得到单个核细胞,定性检测临床患者sCD137基因突变。结果在THP-1细胞检测到两种sCD137L的突变类型,命名为m1和m2。m1型突变在AML患者发生率较低;m2型突变发生率依下列次序递减:M2>M1=M6>M4>M5>M3;m2型突变与AML疾病进展密切相关(P<0.05～0.01)。结论 sCD137L变化与AML疾病发展和发生类型相关,开展临床检测sCD137L有助于监控AML的治疗和预后判断。

T细胞表达CD137L分子介导对血管内皮细胞的活化刺激效应

目的探讨活化T细胞表面表达的CD137L分子对内皮细胞功能的影响。方法将活化的T细胞与内皮细胞共培养,ELISA检测共培养上清中IL-1、IL-8的含量;流式细胞仪检测内皮细胞表面粘附分子ICAM-1的表达变化,并观察用融合蛋白CD137-Fc阻断CD137-CD137L共刺激通路后内皮细胞分泌细胞因子的变化。结果活化的T细胞刺激了内皮细胞活化,诱导了内皮细胞合成和分泌细胞因子IL-1、IL-8以及粘附分子ICAM-1的表达;可溶性融合蛋白CD137-Fc成功地阻断了CD137-CD137L的相互作用,内皮细胞合成和分泌细胞因子的能力降低。结论证明CD137-CD137L的相互作用在内皮细胞与T细胞的相互作用中发挥了重要的作用,提示CD137与其配体交联具有刺激内皮细胞活化的生物学功能。

大肠癌组织CD137L的表达及意义

【目的】检测大肠癌组织及癌旁组织中CD137LmRNA及蛋白的表达情况,探讨其在大肠癌发生进展中的意义。【方法】运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应及冰冻切片免疫组化的方法检测大肠癌组织及癌旁组织中CD137L的表达情况,并分析其表达情况与各临床因素的相关性。【结果】54例大肠癌组织中CD137LmRNA的相对表达水平为0.035±0.013,显著高于癌旁组织的0.008±0.005(P<0.05)。但在不同性别、年龄、肿瘤发生部位、Dukes分期、病理分化及血清CEA水平情况下,CD137LmRNA的表达水平无显著性差异(P>0.05)。随机抽取8例大肠癌肿瘤组织及3例癌旁组织,进行免疫组化检测,结果显示6例CD137L蛋白呈阳性表达,CD137L表达于肿瘤细胞表面;3例癌旁组织该分子的表达均为阴性。【结论】CD137LmRNA在大肠癌组织中高表达,CD137L分子表达于大肠癌肿瘤细胞表面,提示该分子可能在大肠癌的发生进展中发挥作用。

CD137L对结肠癌细胞株Colo 205生物学行为的影响

目的探讨CD137L对结肠癌细胞株Colo 205生物学行为的影响及其在结直肠癌发生发展中的可能意义。方法 Colo 205细胞在未包被、CD137/Fc包被或IgG1Fc包被的培养板中培养24、48及72 h后,CCK-8法测定细胞增殖;培养48 h后,ELISA法检测培养上清液中IL-8的浓度,transwell侵袭实验检测细胞侵袭力。结果 CD137/Fc组细胞增殖与空白组及IgG1Fc组相比均显著增强;IgG1Fc组细胞增殖情况与空白组相比差异无统计学意义。CD137/Fc组的Colo 205细胞培养上清液中IL-8的浓度为(195.3±24.3)ng/ml,显著高于IgG1Fc组及空白组(P值均为0.000);IgG1Fc组培养上清液中IL-8的浓度为(52.7±11.4)ng/ml,空白组培养上清液中IL-8的浓度为(54.7±12.5)ng/ml,两组IL-8浓度差异无统计学意义(P=0.891)。侵袭实验结果示,CD137/Fc组的迁移细胞数为(105±10)个/视野,显著高于IgG1Fc组及空白组的透膜细胞数(P值均为0.000)。IgG1Fc组的透膜细胞数为(57±3)个/视野,空白组透膜细胞数为(60±6)个/视野,两组差异无统计学意义(P=0.602)。结论 CD137L能显著促进Colo205细胞的增殖、IL-8分泌及增强细胞的侵袭力,CD137L可能在结直肠癌的发生进展及转移中发挥作用。

CD137/CD137L在食管癌中表达与预后的相关性分析

目的研究食管癌中CD137/CD137L的表达情况,并分析两者在食管癌中表达的意义及其与预后的关系。方法以购自上海芯超生物科技有限公司的食管癌组织芯片为研究对象,采用免疫组织化学方法检测组织芯片中87例食管癌组织及其相应的癌旁组织中CD137/CD137L的表达情况;采用χ~2检验或Fisher's精确检验的方法分析食管癌及癌旁组织中CD137/CD137L的表达与临床病理特征的关系;采用Kaplan-Meier法分析CD137/CD137L的表达与食管癌患者预后的关系。结果在87例食管癌组织和相应的癌旁组织中CD137的阳性表达率分别为36.8%和72.4%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。在87例食管癌组织和相应的癌旁组织中CD137L的阳性表达率分别为57.5%和96.6%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。食管癌中CD137表达阳性率与浸润深度相关(P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、临床分期均不相关(P>0.05)。食管癌中CD137L表达与临床分期相关(P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、浸润深度均不相关(P>0.05)。CD137表达与食管癌患者的预后不相关(P=0.6301),CD137L表达与食管癌患者的预后相关(P=0.0368)。结论 CD137L的表达水平是影响食管癌患者预后的独立因素;CD137/CD137L可能在食管癌的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。

血清TLR4、CD137L和T淋巴细胞亚群联合检测在诊断CHB严重程度方面的临床价值

目的:探讨对慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者进行血清TLR4、CD137L和T淋巴细胞亚群联合检测在诊断其病情严重程度方面的临床价值。方法:选取2018年3月至2020年7月期间南京医科大学附属无锡市人民医院收治的242例CHB患者和同期在该医院进行健康体检的50例健康人作为研究对象。根据CHB患者病情的严重程度将其分为轻度组、中度组和重度组。将50例健康人作为健康组。检测所有研究对象血清TLR4、CD137L和T淋巴细胞亚群的水平。分析CHB患者血清TLR4、CD137L和T淋巴细胞亚群的水平与其病情严重程度的相关性,评估进行血清TLR4、CD137L和T淋巴细胞亚群联合检测在诊断其病情严重程度方面的价值。结果:轻度组患者与健康组研究对象血清TLR4及CD137L的水平相比,P>0.05。中度组患者及重度组患者血清TLR4及CD137L的水平均高于健康组研究对象,P<0.05。轻度组患者、中度组患者及重度组患者血清CD3^(+)、CD4^(+)的水平及CD4^(+)/CD8^(+)均低于健康组研究对象,其血清CD8^(+)的水平均高于健康组研究对象,P<0.05。中度组患者及重度组患者血清CD3^^(+)、CD4^(+)的水平及CD4^(+)/CD8^(+)均低于轻度组患者,其血清TLR4、CD137L及CD8^(+)的水平均高于轻度组患者,P<0.05。重度组患者血清CD3^(+)、CD4^(+)的水平及CD4^(+)/CD8^(+)均低于中度组患者,其血清TLR4、CD137L及CD8^(+)的水平均高于中度组患者,P<0.05。CHB患者血清CD3^(+)、CD4^(+)的水平及CD4^(+)/CD8^(+)与其病情严重的程度呈负相关性,其血清TLR4、CD137L及CD8^(+)的水平与其病情严重的程度呈正相关性,P<0.05。与单独进行血清TLR4、CD137L或T淋巴细胞亚群检测相比,为CHB患者使用血清TLR4、CD137L和T淋巴细胞亚群联合检测的方法诊断其病情严重程度的敏感度、准确度及特异度更高,P<0.05。结论:对CHB患者进行血清TLR4、CD137L和T淋巴细胞亚群联合检测在诊断其病情严重程度方面具有较高的临床价值。

CD137-CD137L信号通过TRAF6/JNK/AP-1通路调控小鼠血管平滑肌细胞活化T细胞核因子c1表达

目的探讨CD137-CD137L信号是否通过肿瘤坏死因子受体相关因子6/c-Jun氨基末端激酶/活化蛋白1(TRAF6/JNK/AP-1)途径调控小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)活化T细胞核因子c1(NFATc1)的表达。方法采用组织块原代培养小鼠VSMC,第3~5代细胞用于实验。VSMC分为6组:对照组、CD137刺激组、CD137抑制组、siTRAF6干预组、siJNK干预组、siAP-1干预组。Western blot检测各组TRAF6、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化AP-1(p-AP-1)、NFATc1蛋白表达水平。免疫荧光法检测各组TRAF6、p-JNK、p-AP-1、NFATc1荧光表达。结果 (1)与对照组相比,CD137刺激组(CD137-CD137L信号激活)TRAF6、p-JNK、p-AP-1、NFATc1蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与CD137刺激组相比,CD137抑制组(CD137-CD137L信号抑制)TRAF6、p-JNK、p-AP-1、NFATc1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。(2)采用siRNA技术分别沉默TRAF6、JNK、AP-1后,与CD137刺激组相比,siTRAF6干预组TRAF6、p-JNK、p-AP-1、NFATc1表达明显减少(P<0.05);siJNK干预组TRAF6表达无改变,而p-JNK、p-AP-1、NFATc1表达明显减少(P<0.05);siAP-1干预组TRAF6、p-JNK表达无明显改变,而p-AP-1、NFATc1表达明显减少(P<0.05)。(3)免疫荧光检测显示:CD137刺激组TRAF6、p-JNK、p-AP-1、NFATc1荧光表达量升高(P<0.05);CD137抑制组TRAF6、p-JNK、p-AP-1、NFATc1荧光表达量明显降低(P<0.05);siTRAF6干预组、siJNK干预组、siAP-1干预组TRAF6、p-JNK、p-AP-1、NFATc1荧光表达量与上述蛋白表达结果一致。结论 CD137-CD137L信号可通过TRAF6/JNK/AP-1通路影响NFATc1的表达。

microRNA-124-2在CD137-CD137L信号通路调控小鼠血管平滑肌细胞活化T细胞核因子C1表达中的作用

目的探讨micro RNA-124-2在CD137-CD137L信号通路调控小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)活化T细胞核因子C1(NFATc1)表达中的作用。方法小鼠血管平滑肌细胞采用组织贴块法原代培养,细胞中micro RNA-124-2表达采用RT-PCR法检测;应用脂质体转染技术将micro RNA-124-2的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)转染至小鼠VSMC内,细胞中NFATc1 m RNA及蛋白表达采用实时荧光定量PCR及Western blot方法检测;应用双荧光素酶报告检测micro RNA-124-2对NFATc1-3'UTR的作用。结果 anti-CD137特异性刺激CD137-CD137L轴后,平滑肌细胞micro RNA-124-2表达较对照组降低(0.29±0.13比1.00±0.00,P<0.05),而anti-CD137L特异性阻断CD137-CD137L轴后,细胞中micro RNA-124-2表达较对照组增加(3.42±0.17比1.00±0.00,P<0.05);与阴性对照组相比,升高或下调micro RNA-124-2的表达均可逆转CD137-CD137L轴对NFATc1的作用;双荧光素酶报告系统显示micro RNA-124-2对NFATc1-3'UTR有抑制作用(0.283±0.011比1.294±0.143,P<0.001)。结论 CD137-CD137L受体-配体轴可以通过调控micro RNA-124-2进而影响NFATc1的表达。

人源CD137L基因在不同表达系统中表达效率的比较

比较分析人源CD137L在毕赤酵母、枯草杆菌及大肠杆菌中的表达差异,建立适合CD137L的表达系统并检测CD137L的生物学活性。设计PCR引物,以酵母表达质粒pPIC9K-CD137L为模板,扩增CD137L片段,分别构建枯草杆菌表达质粒及大肠杆菌表达质粒,再转化至相应的宿主菌并筛选阳性转化子;SDS PAGE电泳分析CD137L的表达情况并比较差异;稀释复性法复性CD137L包涵体,用离子交换层析纯化CD137L;T细胞激活试验检测CD137L的活性。CD137L在3个表达系统中均可以表达并且得到质谱鉴定,但是在毕赤酵母、枯草杆菌中的表达量微弱,而在大肠杆菌中CD137L以包涵体形式高效表达,平均1 L培养液能得到0.8 g包涵体沉淀,200 mg变性蛋白。经复性纯化后得到的CD137L能有效激活T细胞增殖并且其刺激活性呈现浓度依赖效应。与毕赤酵母、枯草杆菌相比,大肠杆菌表达系统能高效表达CD137L蛋白,并且经稀释复性后CD137L保持了刺激小鼠T细胞增殖的活性。

CD137L在HBsAg DNA疫苗诱导小鼠细胞免疫应答中的佐剂效应

目的:研究共刺激分子CD137L重组质粒对HBsAg DNA疫苗诱导小鼠细胞免疫应答和回忆反应的佐剂作用。方法:将小鼠CD137L真核表达载体(pcD137L)体外转染NIH3T3细胞,RT-PCR、流式细胞仪和免疫荧光法分别检测CD137L mRNA和蛋白的表达;pcD137L与HBsAg DNA疫苗(pcDS)通过肌肉注射联合免疫BALB/c小鼠,LDH释放法测定体外脾细胞特异性CTL杀伤活性;流式细胞仪分析小鼠脾脏CD8+记忆T细胞数量;流式细胞仪检测CD8+T细胞及淋巴细胞中IFN-γ和IL-4的表达水平。结果:重组质粒pcD137L在NIH3T3细胞中获得有效表达。与pcDS单独免疫组比较:免疫后1周,pcDS+pcD137L免疫组能诱导更强的HBsAg特异性CTL杀伤活性(P<0.05);免疫后1周和12周,pcDS+pcD137L免疫组CD8+T细胞CD44high和CD127表达水平均显著增高(P<0.05或P<0.01);免疫后1周、12周和13周(即再次给予pcDS刺激后1周),pcDS+pcD137L免疫组分别明显上调CD8+T细胞和淋巴细胞中IFN-γ产生细胞的百分比,差异有显著意义(均P<0.05)。结论:共刺激分子CD137L能显著增强HBsAg DNA疫苗诱导的Tc1(I型)细胞免疫、特异性CTL应答及回忆反应,是诱导HBV特异性T细胞应答的有效佐剂。