根癌农杆菌介导大麦Mlo反义基因转化小麦

应用含有大麦Mlo反义基因表达载体的根癌农杆菌菌株AglⅠ ,对 3种基因型小麦 (核生 3号、烟优 36 1、扬麦15 8)的愈伤组织进行了转化 .从其中 2种基因型获得 2 3株转基因植株 ,有 2株是白化苗 ,转化频率分别为 1.9%(核生 3号 )和 2 .8% (扬麦 15 8) .PCR及Southern分析表明 ,外源基因已整合进植物基因组 .实验结果表明 ,筛选压力的存在对转基因植株的获得至关重要 ,在无筛选压力下未获得转基因植株 .

反义调控DNA甲基转移酶3b基因对人胆管癌细胞QBC939生长的影响

目的观察转染反义DNMT3 b基因真核表达质粒对人胆管癌细胞QBC 9 3 9生长的影响,初步探讨DNMT3 b基因在胆管癌发生中的作用。方法构建反义DNMT3 b基因真核表达质粒,用脂质体介导法将其转入人胆管癌细胞株QBC 9 3 9;W estern blot检测转染前后DNMT3 b蛋白表达的变化;MTT法和软琼脂克隆形成试验观察细胞的生长增殖能力;流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果转染反义基因能使DNMT3 b蛋白表达水平降低;转染反义DNMT3 b基因不能抑制QBC939的生长曲线,对其软琼脂克隆形成率亦无影响(P=0.7 1 7);转染反义DNMT3 b基因不能改变QBC 9 3 9的细胞周期和促进细胞凋亡(P=0.0 8 9)。结论转染反义DNMT3 b基因真核表达质粒可下调DNMT3 b在QBC 9 3 9细胞中的表达水平,但对QBC 9 3 9的生长和增殖无影响,也不能改变QBC 9 3 9的细胞周期和促进细胞凋亡的发生。

Tiam-1反义基因抗肿瘤侵袭转移作用的研究

目的:从基因—蛋白—细胞效应多层次水平,观察Tiam-1反义基因下调肿瘤细胞内转移相关基因Tiam-1 mRNA和调节细胞骨架结构的Rho蛋白表达水平,探讨遏制肿瘤侵袭转移的作用和机制。方法:采用反义核酸技术合成Tiam-1反义寡核苷酸,硫代化修饰与脂质体形成复合物(Tiam-1 ASODNS-Lf),转导入人高转移巨细胞肺腺癌PG细胞。采用RT-PCR技术检测Tiam-1的表达水平,流式细胞术检测Rho蛋白表达水平,Matrigel体外转移模型检测PG细胞的侵袭转移力。结果:Tiam-1 ASODNS-Lf抑制PG细胞Tiam-1 mRNA表达水平,其相对表达值从0.86下降为0.38;显著抑制PG细胞内Tiam-1介导的信号传递相关Rho蛋白表达水平,其表达率从27.96％降至16.86％(P<0.001)。显著抑制穿过人工基底膜的侵袭转移PC细胞数,从945±40下降为649±35(P<0.05)。结论:Tiam-1反义基因下调PG细胞中侵袭诱导基因mRNA表达及其介导的信号传递蛋白Rho的表达,从而遏制其侵袭和转移能力。

bFGF和VEGF在急性白血病中的表达及对HL-60细胞生长的影响

为了研究急性白血病患者血清及细胞株培养上清中碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的表达水平 ,并初步探讨白血病患者VEGF水平的评价方法以及VEGF特异性反义寡脱氧核苷酸(ASODN)的抗血管生成作用 ,用夹心ELISA法测定患者血清、细胞株 (HL 6 0、U937、NB4、JM和K5 6 2 )培养上清中bFGF和VEGF浓度 ,比较其差异 ,将VEGF血清浓度测定值 (pg ml)、血清浓度测定值经外周血血小板计数标化后标化值VEGF PLT(pg 10 6 )分别作为比较指示 ;HL 6 0细胞经不同浓度VEGFASODN作用后 ,利用噻唑蓝、ELISA法分别测定靶细胞的生长状态及其VEGF分泌水平。结果发现 :①急性白血病患者血清bFGF阳性率 (37.5 % )高于健康对照者 (10 % ) (P <0 .0 1) ,在 5株白血病细胞株中 ,NB4 、U937和K5 6 2细胞上清中检测到了bFGF表达 ;②急性白血病患者及健康者血清VEGF测定值差异无统计学差异 ,但二者标化值测相差显著 (P <0 .0 5 ) ;除U937外 ,其余 4株细胞株培养上清中均有VEGF表达 ;③HL 6 0细胞经 0 .5 ,1及 5 μmol LVEGFASODN作用 2 4小时后 ,其存活率与对照组相比明显降低 (P <0 .0 5 ) ;经 1,5 ,2 0 μmol LVEGFASODN作用 2 4小时后 ,HL 6 0细胞培养上清中VEGF浓度均明显低于对照 (P <0 .0 5 )。结论 :

人端粒酶催化亚单位反义分子探针的药代动力学与急性毒性研究

目的分析放射性核素锝[99mTc]标记的人端粒酶催化亚单位反义分子探针的药代动力学与急性毒性作用。方法制备反义分子探针(99mTc-hTERT ASON),进行体内生物分布、药代动力学以及急性毒性实验。结果99mTc-hTERT ASON标记率为(76±5)%,放射性化学纯度达96%以上,比活度为1850kBq.μg-1;主要分布在肾脏、肝脏组织;体内分布符合三室模型;注射48h内,小鼠无不良反应与死亡。结论99mTc-hTERT ASON具有良好组织分布特点,无急性毒性作用;适合作为一种肿瘤分子显像剂应用于活体显像。

人端粒酶逆转录酶基因反义核酸对CEM细胞系端粒酶活性的影响

为了探讨人端粒酶逆转录酶 (humantelomerasereversetranscriptase ,hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸 (antisensephosphorothioateoligodeoxynucleotide ,ASODN)对CEM细胞端粒酶活性的影响 ,采用端粒酶聚合酶链反应 酶联免疫测定法检测CEM细胞的端粒酶活性 ,采用逆转录 聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平 ,以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果显示 :hTERTASODN作用于CEM细胞后 ,hTERTmRNA表达水平明显降低 ;ASODN与CEM细胞共同孵育 48小时 ,hTERT蛋白表达阳性率降为 (40 .43± 2 .0 7) % ,72小时hTERT蛋白表达阳性率降为 (15.2 6± 2 .74) % ,而hTERT正义核酸作用CEM细胞 2 4,48,72小时 ,对hTERTmRNA及蛋白表达水平均无影响 ;hTERT基因ASODN作用于CEM细胞48,72小时 ,其端粒酶活性明显降低 ,分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著性差异 (P <0 .0 5)。结论

反义hTR对舌鳞癌细胞系Tca8113作用的初步探讨

目的 观察反义hTR对人舌鳞癌细胞系Tca8113的影响及其与细胞周期和凋亡的关系。方法 脂质体介导真核表达载体PBBS2 12 -hTR转染Tca8113细胞系 ,运用流式细胞仪技术观察细胞周期的改变和凋亡 ,并结合免疫组化和原位杂交技术分析转染前后某些基因表达的变化。结果 转染反义hTR的Tca8113细胞克隆生长减缓 ,群体倍增时间较未转染组和转染空质粒组明显延长 ,流式细胞仪显示转染细胞PI指数下降 ,有亚二倍体凋亡峰出现 ,转染后细胞 p2 1基因表达水平显著增高 ,裸鼠移植瘤实验显示转染后的Tca8113致瘤性减弱。 结论 反义hTR可引起细胞通过细胞周期关卡受阻而显著抑制Tca8113细胞的生长 ,同时激活了某些凋亡程序而导致细胞凋亡 。

灯盏花素抑制血管平滑肌细胞增殖的分子基础研究

目的研究反义凝血酶受体寡核苷酸（antisense thrombin receptor oligo—deoxy—nucleotides，Antisense TR ODNs）及灯盏花素在凝血酶（Thrombin，Ⅱa）诱导的血管平滑肌细胞增殖中的作用，比较二者对血管平滑肌细胞凝血酶受体基因、蛋白表达功能及肌醇代谢的影响，以期在分子水平探讨高血压脑出血预防用药的作用机制以及药物筛选方法。方法应用细胞转染、反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT—PCR）、免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、氚-胸腺嘧啶核苷（^3H—TdR）及。H肌醇掺入实验等对体外培养的第4～6代SD大鼠血管平滑肌细胞的凝血酶受体基因、蛋白表达功能、核酸及肌醇代谢进行测定。探索灯盏花素和反义凝血酶受体对血管平滑肌细胞增殖的影响。结果灯盏花素和反义凝血酶受体寡核苷酸均明显抑制凝血酶诱导的大鼠血管平滑肌细胞的增殖，与对照组、正义组相比差异有统计学意义（P〈0．05），RT—PCR、Western blot及ELISA试验结果显示灯盏花素和反义凝血酶受体显著抑制了大鼠血管平滑肌细胞凝血酶受体mRNA和蛋白的表达；且明显抑制了血管平滑肌细胞磷酸肌醇代谢。灯盏花素和反义凝血酶受体对平滑肌细胞增殖的抑制效应差异无统计学意义。结论灯盏花素和凝血酶受体反义序列明显抑制血管平滑肌细胞增殖，其作用机制为通过抑制凝血酶受体基因的表达（mRNA和蛋白的表达），抑制细胞内信号传递来完成。灯盏花素在预防治疗高血压脑出血中的作用机制之一是通过阻断凝血酶受体表达抑制血管平滑肌细胞增殖而实现的。

乙肝表面抗原室内弱阳性质控物的制备及其应用评价

目的制备长期使用且稳定性好的HBsAg室内弱阳性质控血清。方法以小牛血清磷酸盐缓冲液按不同稀释倍数1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32等比例梯度稀释HBsAg阳性血清;以2种厂家提供不同批号的检测试剂,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法对HBsAg阳性质控血清进行连续6个月检测,以此对HBsAg阳性质控血清稳定性进行评价。结果以吸光度值/临界值（S/CO）1.0-3.0为参考标准,确定该实验室HBsAg阳性质控血清的最佳稀释度为1∶8[其S/CO值为2.42,变异系数（CV）为4.72];且该质控血清在不同试剂使用稳定性较好（其S/CO范围为2.41-2.82,CV范围为4.24%-8.68%）;HBsAg阳性质控血清连续6个月检测结果CV范围为8.71%-9.86%（CV〈10%）。结论自制HBsAg质控血清具有很好的稳定性和精密度,可作为临床常规HBsAg检测中的室内质控血清。

反义hTERT抑制恶性胶质瘤生长的体内外研究

目的探讨腺病毒介导的反义hTERT在体内外对恶性胶质瘤细胞生长的影响。方法构建含有hTERT反义序列的腺病毒载体在体内外转染恶性胶质瘤细胞系U251，检测肿瘤细胞生长情况、细胞周期变化、端粒酶活性、hTERT蛋白表达等。结果腺病毒介导的hTERT反义治疗在体外明显抑制肿瘤细胞生长，增殖减慢，凋亡增多，细胞较多聚集在G0／G0期，转染后第6天细胞生存率为46．9％，端粒酶活性和hTERT蛋白表达都明显下降，在体内实验中肿瘤生长明显减慢。结论腺病毒介导的反义hTERT在体内外能明显抑制恶性胶质瘤细胞的生长。

肝细胞癌高表达新基因BC047440功能的研究

目的探讨肝细胞癌高表达新基因BC047440在肝癌形成中的作用。方法通过 DOTAP^(TM)脂质体介导的转染技术,将BC047440基因反义真核表达载体导入HepG2肝癌细胞,经 C418筛选,获得稳定表达BC047440反义基因的HepG2肝癌细胞。采用半定量RT-PCR检测反义基因对转染细胞的内源性BC047440基因抑制效果,噻唑蓝(MTT)比色法观察转染细胞生长曲线及流式细胞术比较细胞周期的变化。结果转染BC047440反义基因的肝癌细胞内源性BC047440 基因受到有效抑制,细胞生长速度明显减慢,细胞周期中G_1,期细胞比例明显增高。结论肝细胞癌高表达基因BC047440可能是一个新的肝癌相关基因,在肝癌中的异常高表达可能对肝癌的发生发展具有一定的促进作用。