RNA干扰Apollon基因逆转白血病K562细胞多药耐药

背景与目的:Apollon基因在白血病等多种肿瘤内高表达。本试验通过构建高效干扰Apollon基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,探讨RNA干扰技术能否逆转人髓系白血病K562细胞多药耐药。方法:构建靶向Apollon基因真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-Apollon,应用LipofectamineTM2000转染K562细胞,G418稳定筛选。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、细胞免疫荧光法分别检测重组载体稳定转染K562细胞后Apollon mRNA及蛋白的表达情况;四甲基偶氮唑盐(MTT)、流式细胞术检测细胞转染前后对长春新碱(leurocristine,VCR)、足叶乙苷(etoposide,VP16)的敏感性及凋亡率的变化。结果:成功构建了pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体并在K562细胞内稳定表达的细胞克隆,经G418筛选后,重组载体能有效沉默Apollon的表达,Apollon mRNA及蛋白表达水平明显下降。MTT结果显示,基因干扰组细胞对VCR、VP16的敏感性明显增强,其半数抑制浓度(half-inhibitory,IC50)值分别为(0.144±0.018)mg/L、(17.336±3.571)mg/L,明显低于细胞对照组(P<0.05)。流式细胞术检测结果表明,基因干扰组细胞联合化疗药物后细胞凋亡率显著升高(P<0.05),而转染阴性对照组细胞凋亡率与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体能显著增强VCR和VP16对白血病K562细胞的诱导凋亡作用,提高K562细胞对化疗药物的敏感性,提示RNA干扰Apollon基因表达能一定程度逆转白血病细胞的多药耐药。

Smac和Apollon基因在胃癌中的表达及与细胞凋亡的关系

目的研究Smac、Apollon基因在胃癌组织表达及两者在胃癌发生中的作用关系。方法逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Smac、Apollon的mRNA在38例胃癌组织,15例癌旁组织和10例正常组织的表达情况。结果38例胃癌标本中表达Smac有20例(52.6%),而除3例癌旁组织外,其他癌旁组织和正常胃组织中均见Smac表达,可见smac在胃癌组织中低表达和非胃癌组织中高表达,具有统计学意义(P<0.05)。Apollon在癌组织、癌旁组织和正常胃组织中分别有29例(76.3%)4、例(26.7%)和0例(0%)表达,Apollon在胃癌组织、癌旁组织和正常组织中Apollon的表达差异具有统计学意义(P<0.05)。结论Apollon在胃癌组织中高表达,其表达和Smac呈明显的负相关,两者的互相作用可能是导致胃癌发生、发展的重要因素。

siA pollon抑制P-gp逆转白血病细胞耐药机制的研究

目的观察Apollon siRNA靶向沉默Apollon基因能否降低多药耐药(MDR)P糖蛋白(P-gp)表达,进而逆转K562/DNR多药耐药。方法将细胞分为实验组(脂质体转染靶向Apollon的siRNA K562/DNR)、细胞对照组(K562/DNR)和阴性对照组(脂质体转染的siRNAnc)。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测三组细胞Apollon mRNA表达情况;采用Western Blotting法检测三组P-gp糖蛋白表达水平;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞转染前后对长春新碱(VCR)、柔红霉素(DNR)的敏感性。比较三组细胞Apollon mRNA表达情况、P-gp糖蛋白表达情况;分析细胞转染前后对VCR、DNR的敏感性。结果实验组Apollon mRNA的相对表达量为(24.233±0.108)%,低于细胞对照组的(90.031±0.182)%和阴性对照组的(83.686±0.076)%,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组P-gp糖蛋白表达水平低于细胞对照组及阴性对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组K562/DNR的VCR、DNR的IC50值明显高于细胞对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组未加药、DNR、VCR的K562/DNR的凋亡率均显著高于细胞对照组的(37.120±0.309)%和阴性对照组的(36.316±0.193)%,差异具有统计学意义(P<0.05);K562/DNR对化疗药VCR和DNR敏感性明显增强。结论siApollon能显著抑制K562/DNR细胞增殖,且P-gp的表达明显降低,提高K562/DNR细胞对化疗药物的敏感性,促进K562/DNR的凋亡,提示RNA干扰Apollon基因表达能在很大程度上提高K562/DNR对化疗药物的敏感性。

Apollon siRNA联合川芎嗪对白血病细胞增殖及凋亡的影响

目的观察Apollon siRNA靶向沉默Apollon基因联合川芎嗪(TMP)对人慢性粒细胞白血病细胞株K562增殖及凋亡的影响。方法根据前期实验筛选出的干扰效果最佳的Apollon siRNA片段,构建pGPHIGFP-Neo-Apollon真核表达载体,并将构建成功的载体转染至K562细胞。将实验分为细胞对照组(未行任何处理)、阴性对照组(转染阴性质粒载体)和RNA干扰组(转染pGPHI-GFP-Neo-Apollon质粒载体),利用RT-PCR法和细胞免疫荧光法分别检测各组细胞Apollon mRNA及蛋白的表达情况;再于上述分组基础上新增TMP组(施加320μg/mL TMP)、TMP+阴性对照组和TMP+RNA干扰组,应用MTT法和流式细胞术分别检测各组K562细胞的增殖能力和细胞凋亡率。结果构建的pGPHI-GFP-Neo-Apollon载体能在K562细胞内稳定表达;RNA干扰组Apollon mRNA及其蛋白的相对表达水平明显低于细胞对照组和阴性对照组(均P<0.05);RNA干扰组K562细胞的增殖抑制率和凋亡率高于细胞对照组(P<0.05),与RNA干扰组及TMP组比较,siRNA转染联合TMP能显著提高K562细胞的增殖抑制率和凋亡率(均P<0.05)。结论 Apollon siRNA转染能显著抑制K562细胞增殖并促进其凋亡,且与TMP联合使用对提高K562细胞的增殖抑制率和凋亡率具有显著协同作用,提示siRNA技术联合药物在白血病治疗中具有重要的潜在价值。

Apollon特异性siRNA序列的筛选及功能鉴定

目的 筛选干扰Apollon基因表达的siRNA序列并鉴定其功能.方法 采用化学方法合成针对Apollon基因不同位点的siRNA序列;应用Lipofectamine 2000转染人类乳腺癌MCF-7细胞;反转录PCR（RT-PCR）检测Apollon mRNA表达水平;细胞免疫荧光结合激光共聚焦技术定量分析Apollon蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝（MTT）和流式细胞术分别检测siRNA干扰Apollon后对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响.结果 合成的3对siRNA序列均能抑制Apollon mRNA表达,其siRNA1、siRNA2、siRNA3对ApollonmRNA的抑制率分别为（36.201±11.629）％、（67.308±7.686）％、（47.123±12.000）％,与对照组相比差异均有统计学意义（均P＜ 0.05）;siRNA2转染MCF-7细胞后Apollon蛋白的荧光强度为（14.97±2.08）％,增殖抑制率达（73.361±2.118）％,凋亡率为（28.793±0.743）％.结论 筛选出的siRNA2序列可有效沉默Apollon基因的表达,显著抑制MCF-7细胞的增殖和促进其凋亡,为肿瘤靶向治疗提供实验依据.

Apaf-1基因启动子甲基化与抑凋亡蛋白Apollon表达在成人急性白血病发生发展中的意义

目的 探讨Apaf-1基因启动子甲基化与抑凋亡蛋白Apollon在成人急性白血病（AL）发生发展中的作用.方法 采用甲基化特异性PCR（MS-PCR）检测53例AL患者骨髓细胞基因启动子区域甲基化情况,RT-PCR方法 检测Apaf-1 mRNA表达水平.免疫细胞化学方法 检测Apollon蛋白表达情况,正常骨髓对照为10名正常人和非恶性血液病患者.结果 18例（33.9%）AL患者Apaf-1基因启动子存在异常甲基化,甲基化检测阳性患者均未检测到Apaf-1 mRNA的表达,对照组仅1份Apaf-1 mRNA表达缺失,MS-PCR检测未发现Apaf-1基因启动子的异常甲基化,AL患者Apaf-1基因甲基化阳性率高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,AL患者骨髓细胞Apollon蛋白表达水平高于对照组（P＜0.05）,AL患者外周血WBC＞10×109/L的患者Apaf-1基因启动子甲基化阳性率及Apollon蛋白表达水平高于WBC≤10×109/L患者,差异有统计学意义（P＜0.05）,AL患者中Apaf-1基因启动子甲基化阳性率与Apollon蛋白表达呈正相关.结论 Apaf-1基因启动子的异常甲基化与抑凋亡蛋白Apollon的高表达在白血病的发生发展中可能起协同作用,共同促进了白血病的发生、发展.