基于化学发光酶免疫分析法检测花生过敏原Ara h 2

Ara h 2是花生主要过敏原之一,为开发食物中Ara h 2过敏原成分的快速检测方法,减少因误食导致花生过敏事件的发生,该研究采用鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,通过棋盘法优化抗体工作浓度,建立了一种检测花生过敏原Ara h 2的间接双抗夹心化学发光酶免疫分析法,并对该方法的灵敏度、准确度、精密度和特异性进行评价。该方法的检出限为1.085 ng/mL,线性范围为3.12~200 ng/mL,添加回收率为78.30%~94.39%,批内和批间变异系数均小于10%,且特异性良好,与其他常见食物过敏原无交叉反应。该方法与相同抗体所建立的间接双抗夹心酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法相比,在灵敏度上表现出一定优势。该研究开发的化学发光酶免疫分析法可对花生食品生产过程中和消费前的Ara h 2过敏原成分检测提供可靠的技术支持。

DNA提取方法对实时荧光定量PCR检测花生过敏原Ara h 2基因的比较研究

食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠(Sodium Lauroyl Sarcosine)磁珠法的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生质量分数为0.05%~1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用1条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。

经基因工程改造的花生主要过敏原Ara h 2制备及其低致敏原性鉴定

构建经基因工程改造的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其过敏原性。将花生主要过敏原Arah 2基因序列进行颠换,并将颠换后的序列进行合成,再将合成后的基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;利用Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside(IPTG)诱导表达;通过Ni2+亲和层析纯化目的蛋白;Western blotting和ELISA鉴定该重组蛋白的过敏原性。测序结果表明合成后的序列成功整合到原核表达载体pET-32a(+)上。重组的目的蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,蛋白大小与理论值相符。Western blotting和ELISA结果均表明经基因工程改造的Ara h 2(F-Ara h 2)蛋白与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏患者混合血清中IgE显著降低。成功构建经基因工程改造的Ara h 2表达载体,初步的体外实验表明该基因表达的重组蛋白具有低致敏原性。

^(60)Co-γ辐照对花生过敏原Ara h 2蛋白构象及致敏活性的影响

为探讨辐照处理对花生Ara h 2蛋白结构与致敏活性的影响,采用不同剂量^(60)Co-γ辐照处理分离纯化所得到的花生过敏原Ara h 2蛋白,结合紫外扫描光谱、圆二色谱(CD)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评估辐照处理后Ara h 2蛋白的结构变化,并用免疫印迹法和间接酶联免疫吸附法检测辐照处理后Ara h 2的抗原性变化。结果表明,^(60)Co-γ辐照处理可以显著改变花生Ara h 2蛋白的构象,使其降解、发生交联。随着辐照剂量的增大,Ara h 2蛋白与抗体的结合能力呈逐渐下降趋势,且与蛋白紫外吸光度的增强和α-螺旋含量的降低呈现良好的相关性。当辐照剂量为10 kGy时,可基本破坏Ara h 2蛋白的结构和免疫活性。^(60)Co-γ辐照处理可以有效降低花生过敏原Ara h 2蛋白的致敏性,这为花生脱敏技术的研究提供了新思路。

设计和鉴定花生主要过敏原Ara h 2低致敏原衍生物

构建序列重新组合的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。将Ara h 2基因进行合理的缺失和重排,并将重排后的基因T-Ara h 2克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;再用IPTG诱导其表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western-blotting和ELISA鉴定该重组蛋白的低致敏原性。测序结果表明重排后的序列成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)上。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western-blotting和ELISA结果均表明:T-Ara h 2与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低。成功构建了基因重排的Ara h 2表达载体,该重组蛋白具有良好的低致敏原性。

超高效液相色谱-电喷雾质谱法检测花生过敏原Ara h 2

目的建立烘培食品中花生过敏原Ara h 2的液相质谱联用定量检测方法。方法选择花生蛋白中的致敏蛋白Ara h 2作为目标蛋白,筛选出该致敏蛋白的特异肽,人工合成特异肽标准品和特异肽内标,从而建立直接检测花生致敏蛋白Ara h 2的准确定量方法。同时还对全国不同地区的20种花生中致敏蛋白Ara h 2的含量进行检测分析,初步统计得出致敏蛋白Ara h 2和花生蛋白的换算系数,并以Ara h 2作为生物标记物检测10种烘培食品中花生蛋白的残留量。结果花生样品中致敏蛋白Ara h 2的定量限为4.45μg/g,回收率在106.0%~107.8%之间。烘培食品中,定量限可达到6.23μg/g,回收率在107.0%~113.2%之间。结论本方法特异性强、灵敏度高、定量准确,具有良好的应用前景。

转谷氨酰胺酶催化的花生过敏原Ara h 2交联反应位点分析

酶催化交联是蛋白质改性的常用加工手段,交联方式和交联位点不同,对蛋白质性质的影响也不同。采用转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,MTG)催化Ara h 2发生交联反应。通过液相-质谱联用对交联后的蛋白产物进行分析,再利用StavroX软件分析质谱数据,寻找不同反应条件下,蛋白质交联反应的发生位点。结果显示,在MTG的催化下,K142、K52均参与交联反应。还原后的Ara h 2的交联反应较未还原蛋白更为活跃,未还原蛋白中仅发现3对分子内交联肽段,而还原后的蛋白中找到16对交联肽段(既包括分子内交联也包括分子间交联),但还原蛋白中仅K142参与了分子内交联反应。研究揭示的Ara h 2交联方式和交联位点,为交联反应对蛋白质改性机制研究奠定了基础。

基于光谱技术分析不同还原糖对Ara h2糖基化反应的影响

糖基化反应能诱导食品中蛋白质的结构发生改变;Ara h2是花生中的主要蛋白组分之一,可以作为一种模式蛋白研究花生蛋白糖基化产物的结构变化。不同还原糖对Ara h2糖基化反应的影响目前未见相关报道。以花生蛋白Ara h2为研究对象,通过SDS-PAGE、内源荧光、同步荧光、紫外、圆二色谱、红外等光谱技术研究Ara h2糖基化前后分子量、二级、三级结构以及官能团的变化,分析六种还原糖(核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖)对花生蛋白Ara h2糖基化产物结构的影响,阐明经不同还原糖修饰后花生蛋白Ara h2的结构变化。SDS-PAGE电泳表明木糖和核糖修饰的花生蛋白Ara h2电泳条带明显上移,糖基化程度最大;紫外光谱分析表明糖基化反应会改变花生蛋白Ara h2的吸收峰强度。五碳糖修饰的花生蛋白Ara h2具有最强的吸收强度,其中五碳糖中木糖的吸收峰强度最大;内源荧光、同步荧光和三维光谱实验结果表明,糖基化修饰会使花生蛋白Ara h2的荧光强度降低,且五碳糖修饰的Ara h2荧光强度最低。分析认为由于糖基化修饰使花生蛋白Ara h2的结构展开,导致芳香族氨基酸暴露在水环境中,从而引起荧光猝灭;圆二色谱分析表明不同还原糖修饰的Ara h2糖基化产物α-螺旋含量都增加,其中木糖修饰的α-螺旋含量最大(15.6%);红外光谱分析表明木糖和核糖修饰的花生蛋白Ara h2的吸收峰分别从3327.41 cm^(-1)红移至3318.43和3321.09 cm^(-1),1700~1600 cm^(-1)处木糖和核糖修饰的花生蛋白Ara h2吸收峰强度略高于其他还原糖修饰的该蛋白。不同还原糖对Ara h2糖基化反应后的糖基化产物结构的影响不同,还原糖的碳链越短、空间位阻越小,糖基化反应程度越高,对Ara h2的结构影响越大。

双抗体夹心ELISA检测花生致敏蛋白Ara h 2的方法建立

根据双抗体夹心检测原理,以Ara h 2鼠源单抗(mAb)为捕获抗体, Ara h 2兔源多抗(pAb)为检测抗体,建立ELISA方法,通过棋盘法优化抗体工作浓度,并对方法的灵敏度、准确度、特异性、稳定性等检测特性进行鉴定。结果表明, mAb和pAb最佳工作浓度分别为1︰15 000稀释和1︰10 000稀释,在此基础上建立的标准曲线线性范围为2~128 ng/mL,检测限为2.32 ng/mL,添加回收试验平均回收率为87.6%~93.3%,且方法与其他常见致敏蛋白无交叉反应,并可在4℃避光密封条件下保持90 d内检测结果稳定。所建立的双抗体夹心ELISA方法检测特性良好,可用于花生致敏蛋白Ara h 2快速筛查,为食品标签中花生致敏物质标识信息的高效监管提供技术支撑。

热加工对花生过敏原Ara h2抗原性及构象的影响

从花生种子中分离纯化花生过敏原Ara h 2,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、圆二色谱(CD)、ANS荧光探针及紫外可见(UV-Vis)光谱等方法,系统研究热加工对Ara h 2抗原性和结构的影响。结果表明:Ara h 2蛋白经55或70℃处理后其抗原性略有升高,经85,100或115℃处理后,其抗原性显著降低,且随着温度和时间的增加其抗原性均不断降低。CD色谱分析表明,Ara h 2经热处理后其二级结构发生变化;ANS荧光探针光谱显示,不同的热处理均导致Ara h 2表面疏水性增加。紫外光谱显示,不同温度对Ara h 2处理30 min后(除55℃外),其紫外吸收值均升高。Ara h 2经100℃处理不同时间后,其紫外吸收值均有增加。由此推断,花生过敏原Ara h 2的构象改变导致了其抗原性的降低。

还原协同加热处理对花生过敏原Ara h2结构及抗原性的影响

花生过敏能引起荨麻疹、呕吐甚至休克等症状,通常是终生性过敏。本研究运用加热处理、半胱氨酸还原对Ara h2进行单独和复合处理,采用圆二色谱、紫外扫描光谱、间接竞争酶联免疫吸附法分别检测蛋白加工前后的结构与抗原性变化。结果显示,单一的加热和半胱氨酸还原处理过的蛋白结构与抗原性只发生部分变化。而复合处理中,在加热条件下,半胱氨酸还原蛋白的能力明显增强,还原后的蛋白二级结构与三级结构发生大幅变化,抗原性显著降低。研究结果表明,二硫键对于蛋白Ara h2结构稳定具有重要作用,二硫键被还原和加热过程破坏后,蛋白的抗原性和结构即发生重大变化。还原协同加热处理有望大幅改善2S球蛋白的结构和致敏性,可以作为蛋白脱敏加工的备选方法。

重组花生过敏原Ara h2的生物合成

为获得重组花生过敏原Ara h2。通过RT-PCR合成cDNA,并以此为模板进行PCR扩增目的基因Ara h2,扩增产物经纯化后克隆至pMD19-TSimple载体中,构建重组质粒pMD19-T-Ara h2。上述重组质粒经酶切纯化后定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-Ara h2,并转化表达宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明,该表达蛋白大小约为46kD,与理论值相符。通过Glutathione Sepharose 4B凝胶亲和层析方法纯化融合蛋白GST-Ara h2,获得融合蛋白纯度约为90%。Western blotting分析表明,经纯化的融合蛋白能与抗Ara h2兔血清发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的免疫原性。

经合理的序列重组制备花生主要过敏原Ara h 2低致敏衍生物

目的:构建经序列重组的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。方法:根据已鉴定的Ara h 2 IgE抗原表位,利用基因工程技术将Ara h 2基因进行合理的组合,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western blotting和ELISA鉴定该重组蛋白的低致敏原性。结果:测序结果表明合成后的序列成功转入原核表达载体pET-32a(+)上。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blotting和ELISA结果均表明通过基因工程改造的Ara h 2蛋白(S-Ara h 2)与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低。结论:成功构建了经序列重组的Ara h 2表达载体,该基因表达的重组蛋白具有良好的低致敏原性,这将会为花生过敏患者的脱敏治疗提供了新的安全疫苗基础。

经点突变的花生主要过敏原Ara h2低致敏原的制备与鉴定

目的构建经点突变的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其过敏原性。方法将Ara h 2基因进行点突变,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western-blotting和ELISA检测该重组蛋白的过敏原性。结果测序结果表明合成后的序列成功转入原核表达载体pET-32a(+)上。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western-blotting和ELISA结果均表明经点突变的Ara h 2蛋白(M-Ara h 2)与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低。结论成功构建了经点突变的Ara h 2表达载体,初步的体外实验表明该基因表达的重组蛋白具有低致敏原的潜能。

Ara h2三聚体重组蛋白的制备及其低致敏原性鉴定

目的制备花生主要过敏原Ara h 2三聚体重组蛋白并检测其过敏原性。方法利用分子生物学的方法将3分子的Ara h 2依次串联起来,并将其整合到原核表达载体pET-32a(+),再转化到感受态Origami中;然后利用IPTG诱导其表达;通过Ni2+亲和层析纯化三聚体重组蛋白;Western-blotting和ELISA检测目的蛋白的过敏原性。结果测序结果表明Trimer成功整合到pET-32a(+)上。三聚体重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,蛋白大小与理论值相符。Western-blotting和ELISA结果表明Trimer与重组的Ara h 2(r-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE的能力有所降低。结论成功制备花生主要过敏原Ara h 2三聚体重组蛋白,初步的体外实验表明该重组蛋白具有低致敏原的潜能。

花生内源过敏原蛋白Arah2的分离纯化及鉴定

Arah2蛋白是花生的主要过敏原蛋白之一,为获得高纯度的花生Arah2蛋白,以新鲜花生为原料,通过蛋白浸提、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)回收等方法分离得到目的蛋白,并运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI—TOF/MS)对其进行鉴定。结果表明:该方法可得到纯度较高的纯化蛋白;经质谱鉴定后确定该蛋白为Arah2蛋白,两个同种异型物分子量分别为18.5 kD(Arah2.01)和20.1kD(Arah2.02);层析柱分离和SDS—PAGE电泳回收的得率分别为31.4%和18.6%。

Peanut Allergens Attached with p-Aminobenzamidine Are More Resistant to Digestion than Native Allergens

Despite being known as resistant proteins, peanut allergens (Ara h 1 and Ara h 2) can be digested and cause allergic reactions. Making the allergens more resistant to digestion may aid in non-absorption and excretion of the allergens. Our objectives were to make Ara h 1 and Ara h 2 more resistant to digestion and test them in a model system using trypsin as the digestive enzyme. The resistant allergens were prepared by covalently attaching p-aminobenzamidine (pABA), a protease inhibitor, to peanut allergens in an extract or on a PVDF membrane using glutaraldehyde, and were then tested for resistance to trypsin digestion. SDS-PAGE and Western blot were performed to determine the allergenic capacity of the modified allergens. A control was prepared using glycine instead. Results showed that Ara h 2, when covalently attached with pABA, was more resistant to trypin digestion than the native allergen. Similarly, Ara h 1, prepared on a PVDF membrane and treated with pABA, displayed a resistance to trypsin digestion. Treatment of the allergens with glycine (a control) instead of pABA showed that the modified allergens were as digestible as native allergens. Blot assays showed that the pABA-treated allergens exhibited a lower allergenic capacity than native allergens. It was concluded that pABA, when attached to peanut allergen Ara h 1 or Ara h 2, inhibited digestion of the allergen by trypsin and reduced their allergenic capacity as well.

花生过敏原结构及加工研究进展

花生过敏已成为世界各地普遍存在的公众性健康问题,得到广泛关注,对花生过敏原的研究日渐深入。过敏原结构为加工降低其过敏原性提供基础,用各种加工手段降低甚至消除花生过敏原蛋白的致敏性,尤其是Ara h 1、Ara h 2和Ara h 6、Ara h 3/4这些含量高、致敏性强的主要过敏原的致敏性已备受重视。本文主要介绍花生过敏原研究在结构及加工方面的进展,以期为低致敏甚至脱敏花生的生产提供一定的参考,以保证实现丰富食物过敏患者食品选择的同时,有效降低食品安全风险。