花生过敏原Ara h2.02的克隆、表达及免疫学鉴定

通过提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h2.02基因,将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序,将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中,IPTG诱导表达、Western-blotting检测该重组蛋白的免疫原性.测序结果表明:克隆的花生Ara h2.02基因片段全长为519 bp,编码为172个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同.诱导表达后的蛋白经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western-blotting结果表明该蛋白能与花生过敏病人混合血清中的IgE结合,具有免疫原性.成功克隆并表达了花生过敏原Ara h2.02,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性.

花生过敏原Ara h2.02原核表达方法条件的研究

将重组质粒pET-32a(+)-Arah2.02转化表达宿主菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS—PAGE电泳分析,结果显示表达的蛋白大小约为38kDa。进一步用通用His标签抗体进行Western Blotting检测,结果表明成功克隆表达了花生过敏原Arah2.02。为获得较多的重组蛋白Arah2.02,分别对IPTG浓度、摇床转速、诱导温度和时间等条件进行选择,确定最佳条件为:IPTG浓度0.3mmol/L,摇床转速220r/min,诱导温度37℃,诱导时间2h。