Arkadia表达载体转染肾小管上皮细胞条件的优化

本试验旨在优化泛素化酶Arkadia质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo转染小鼠肾小管上皮细胞(renal tubular epithelialcells,RTECs)的条件,为研究Arkadia表达载体在小鼠马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephrohathy,AAN)中的作用奠定基础。以小鼠RTECs为转染对象、脂质体LipofectamineTM2000为转染介质,采用Real-time PCR和CCK-8法检测不同的质粒与脂质体比例条件下Arkadia mRNA的表达差异及对细胞活性的影响;同时,用Real-time PCR检测不同的转染时间条件下表达载体对Arkadia mRNA沉默效果的差异。结果显示,Arkadia-pGPU6/GFP/Neo载体的转染效率表现出了一定的剂量和时间依赖性。当质粒DNA∶LipofectamineTM2000为0.66μg∶2μL、转染时间为24 h时,对Arkadia mRNA表达的抑制最明显并且对细胞的毒性最小。最终确定了Arkadia-pGPU6/GFP/Neo载体转染小鼠RTECs的最佳条件。

E3泛素连接酶Arkadia的结构特征、生物学功能及其在疾病发生发展中的作用

蛋白泛素化是一种重要的转录后修饰过程,可与蛋白酶体一起识别并降解未折叠蛋白及多余蛋白.E3泛素连接酶Arkadia由RNF-111基因所编码,决定了靶蛋白底物的特异性,是泛素化过程中起决定作用的关键酶.近年来研究发现,Arkadia可以通过泛素化降解细胞内蛋白而发挥增强转化生长因子β信号通路的作用.本文回顾了Arkadia的最新研究进展,对其基本特征、生物学功能及其在疾病发生发展中的作用综述如下.

Arkadia和UCH37表达载体的构建及其对TGF-β1/Smads信号通路的影响

【目的】构建泛素启动酶Arkadia和泛素羧基末端水解酶-5(亦称UCH37)的表达载体,并探讨Smad7蛋白的泛素化修饰对马兜铃酸肾病中TGF-β1/Smads信号通路的影响。【方法】通过观察绿色荧光的表达量及real-time PCR反应优化转染条件,转染Arkadia和UCH37 siRNA,real-time PCR检测mRNA表达抑制率。分别构建Arkadia和UCH37的表达载体pGPU6/GFP/Neo,经鉴定后转染细胞,real-time PCR和Western blotting检测Arkadia、UCH37和Smad7的表达变化。【结果】①30 pmol siRNA和1.5μL LipofectamineTM2000为最佳转染条件;②Arkadia-1490和UCH37-721的干扰效果最明显;③载体的插入序列完全正确,且pGPU6/GFP/Neo-Arkadia能上调马兜铃酸肾病模型中Smad7的表达,而pGPU6/GFP/Neo-UCH37使Smad7表达下降。【结论】成功构建了表达载体pGPU6/GFP/Neo-Arkadia和pGPU6/GFP/Neo-UCH37,且Arkadia和UCH37可分别放大、抑制TGF-β1/Smads信号通路。

Smad泛素化调节因子和Arkadia在大鼠肺纤维化中的作用研究

目的探讨Smad泛素化调节因子(Smurf)和Arkadia在博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化形成中的作用及可能的分子机制。方法将24只无特定病原体级健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型7 d组、模型14 d组、模型28 d组,每组6只。模型组大鼠气管内滴入博莱霉素(10 mg/kg)建立肺纤维化动物模型,对照组气管内滴入等体积0.9%氯化钠注射液。于造模后第7、14和28天分批处死大鼠。应用苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色观察肺组织炎症及纤维化情况;应用逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测Ⅰ型胶原α1(COL1A1)、Arkadia、Smurf1、Smurf2、Smad7、Ski和转化生长因子βⅠ型受体(TβRⅠ)的表达。结果 HE染色和Masson染色显示肺纤维化模型建立成功。模型7、14、28d组大鼠肺组织COL1A1蛋白表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型7、14、28 d组大鼠肺组织Arkadia mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组,Smurf2 mRNA和蛋白表达水平均明显低于对照组(均P<0.05)。模型7 d组大鼠肺组织Smad7和Ski蛋白表达水平明显高于对照组,随后Smad7和Ski蛋白表达水平随时间延长而逐渐降低,至第28天均低于对照组水平(均P <0.05),但各组间Smad7和Ski mRNA表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。模型7、14、28 d组大鼠肺组织TβRⅠmRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组[(0.340±0.056)、(0.520±0.021)、(1.014±0. 190)比(0.244±0.033);(0.453±0. 033)、(0.617±0. 060)、(0. 720±0. 038)比(0.309±0.031)],差异均有统计学意义(均P <0. 05)。结论 Smurf2和Arkadia均参与了博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化形成;Arkadia可能通过泛素化降解蛋白途径实现对Smad7和Ski蛋白表达的下调,促进肺纤维化形成。

骨形成蛋白7干预肝纤维化小鼠肝组织E3泛素连接酶Arkadia表达的实验研究

目的探索E3泛素连接酶Arkadia在CCl4所致肝纤维化小鼠肝组织中的动态表达，以及骨形成蛋白7（BMP-7）对其的阻断作用。方法30只健康雄性ICR小鼠，随机分为正常对照组（6只）、模型组（18只）和BMP-7干预组（6只）;模型组再按不同的时间点分为4周、8周和12周3个亚组。在小鼠双后肢皮下交替注射60%／CCl4／花生油溶液（5ml／kg），每周2次，共持续12周，制备肝纤维化模型;BMP-7干预组在皮下注射CCl4的同时，从第9周开始腹腔注射BMP-7（300pg／g）溶液，隔天1次，共4周。苏木素-伊红（HE）和Masson染色观察肝组织病理变化，RT-PeR、免疫组织化学和Westemblot法检测肝组织中Arkadia的mRNA和蛋白质表达量。样本均数比较用单因素方差分析和（或）配对f检验，方差齐时采用LSD—t检验；相关性分析用Pearson直线相关分析法。结果成功建立了肝纤维化小鼠模型。模型组Arkadia，Smad7和TGFD1的mRNA表达量在纤维化过程中逐渐升高，12周时达高峰（相对表达量分别为1．3434±0．0149、1．2200±0．0093和1．1258±0．0065），BMP-7干预组表达量降低（相对表达量分别为0．9867±0．0169、O．9517±0．0120和0．9029±0．0085），与对照组（相对表达量分别为0．5398±0．0025、0．7467±0．0072和0．6318±0．0041）相比，差异有统计学意义（F值分别为812．801、451．462和998．957，（P值均〈0．01）；BMP-7干预组Arkadia、Smad7和TGFp1的mRNA表达明显低于12周模型组（t值分别为12．108、18．737和16．364，（P值均〈0．01）。正常肝组织中Arkadia、Smad7、TGFp1蛋白仅在汇管区少量表达（相对表达量分别为2．1702±0．0518、2．0798±0．0547和2．4515±0．0487），模型组中其表达量逐渐增加（12周的相对表达量分别为3．4198±0．0279、5．4480±0．0565和5．2619±0．0530），主要在汇管区和肝细胞胞质内表达，BMP-7干预后表达量降低（分别为3．1457±0．0424、3．5616士0．0491和3．5282±0．0195），与对照组相比，差异有统计学意义扩值分别为8．399、609．690和900．561，P值均〈0．01）；与12周模型组相比，BMP-7干预组Arkadia、Smad7、TGFβ1的蛋白质表达量明显降低U值分别为23。438、11．667和42．889，P值均〈0．01）。结论Arkadia在肝纤维化进展过程中呈上升趋势，BMP-7具有抗肝纤维化作用并可以抑制纤维化过程中Arkadia的表达。

Arkadia在TGF-β/Smad信号转导通路中的作用

转化生长因子-β（TGF-β）是一种多功能蛋白,具有调节细胞增殖、分化、迁移及凋亡等多种细胞生物学效应.已有研究证实,TGF-β是重要的促纤维化细胞因子之一,且与肿瘤的发展密切相关.Smad信号是其发挥作用的主要通路.而近年研究发现,E3泛素连接酶Arkadia通过Smad信号能起到增强TGF-β信号通路生物学效应的作用,因而日益引起人们的关注.拟对TGF-β信号转导通路中Arkadia的作用作一综述.

Arkadia上调转化生长因子-β信号促进卵蛋白致敏大鼠气道重塑形成

支气管哮喘（简称哮喘）所致气道重塑的发生与转化生长因子（TGF）-β信号通路的活化密切关联。TGF—β生物学效应的发挥在很大程度上依赖于泛素蛋白酶体通路对TGF-β／Smad通路中基本信号分子的降解而得以实现。在上述过程中，E3泛素连接酶Arkadia和Smurf2能够诱导Smad7、SnoN和Ski的泛素化降解。本研究为明确卵蛋白致敏大鼠气道重塑发生过程中Arkadia和Smurf2对TGF—β信号通路的调控作用，

MG132对高糖条件下肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达及纤维化效应的影响

目的:观察蛋白酶体抑制剂MG132对高糖培养条件下肾小管上皮细胞核转录共抑制因子Sno N蛋白表达的影响,探讨MG132减轻高糖状态下肾小管纤维化病变的作用及可能机制。方法:将体外培养的NRK-52E细胞分为正常组(NG)、高糖组(HG)和不同浓度MG132预处理后高糖培养组(HG+MG132),采用免疫荧光双染的方法观察E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肾小管上皮细胞中的表达和分布,用Western blotting方法检测Sno N、Samd泛素化调节因子2(Smurf2)、Arkadia、E-cadherin、α-SMA和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)等目标蛋白的相对表达量。结果:与NG组相比,HG组肾小管上皮细胞E-cadherin和Sno N表达减少(P<0.05),而α-SMA、Col-Ⅰ、Smurf2和Arkadia表达增多(P<0.05);与HG组相比,不同浓度MG132预处理肾小管上皮细胞后高糖培养,可见肾小管上皮细胞中Sno N和E-cadherin蛋白表达显著上调(P<0.05),而α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表达显著下调(P<0.05),并且这种效应呈量效依赖性,但MG132预处理对Smurf2和Arkadia的表达无影响。结论:MG132可对抗高糖介导的肾小管上皮细胞的纤维化效应,其机制可能是通过减少Sno N蛋白的泛素化降解作用实现的。

高糖作用的肾小球系膜细胞SnoN/Ski蛋白表达及泛素化降解

目的:观察高糖作用的大鼠肾小球系膜细胞内核转录共抑制因子SnoN/Ski及泛素连接酶Arkadia的表达变化,初步探讨SnoN/Ski泛素化降解在糖尿病肾病中的作用。方法:将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分别设正常对照组、高糖甲组(培养基含20 mmol/L葡萄糖)、高糖乙组(培养基含30 mmol/L葡萄糖)、高糖+MG132组(30 mmol/L葡萄糖培养基中预先加入0.5μmol/L特异性泛素蛋白酶体抑制剂MG132)和甘露醇组。用蛋白免疫印迹技术和免疫荧光染色-激光共聚焦显微镜检测各组细胞SnoN/Ski及Arkadia蛋白的表达。结果:(1)正常系膜细胞中SnoN/Ski蛋白大量表达,Arkadia蛋白表达较弱。(2)高糖作用后SnoN/Ski蛋白表达减弱,Arkadia蛋白表达增强(P<0.05)。(3)与高糖组比较,高糖加入MG132后SnoN/Ski蛋白表达增加,Arkadia蛋白表达减弱(P<0.01)。(4)甘露醇组与正常组比较SnoN/Ski及Arkadia蛋白表达均无明显差异(P>0.05)。结论:(1)高糖可通过泛素蛋白酶体途径降解SnoN/Ski蛋白致其低表达。(2)E3连接酶Arkadia参与了高糖诱导的SnoN/Ski的泛素化降解。

氧化苦参碱对糖尿病大鼠肾组织纤维化的作用及可能机制研究

目的探讨氧化苦参碱(OM)对糖尿病(DM)大鼠肾组织纤维化的作用及可能机制。方法 SD大鼠随机分为正常对照(NC)组、糖尿病(DM)组、氧化苦参碱治疗(OM)组大鼠,尾静脉注射STZ复制DM模型,于成模13周起,DMA组大鼠采用OM个体化治疗,以血糖控制在4~7mmol/L,尿糖阴性为准,分别于24周处死各组大鼠。生化方法测血糖、血肌酐和24h尿蛋白;HE和Masson染色观察大鼠肾组织结构改变;免疫组化检测各组大鼠肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、E-钙黏附素(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白(FN)蛋白的表达变化;免疫荧光检测大鼠肾组织中Arkadia和核转录共抑制因子(SnoN)蛋白的表达。结果与NC组相比,DM组大鼠血糖,血肌酐,24h尿蛋白明显增多(P<0.05),并出现肾组织形态学异常改变;而OM组大鼠血糖、血肌酐、24h尿蛋白均显著低于DM组(P<0.05),肾纤维化病变明显改善;DM组TGF-β1、α-SMA和FN蛋白表达显著增加(P<0.05)、E-cadherin蛋白表达显著减少(P<0.05);与DM组相比,OM组TGF-β1、α-SMA和FN蛋白表达显著减少(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著增加(P<0.05);免疫荧光显示Arkadia与SnoN蛋白的表达趋势相反。结论 OM具有抑制DM大鼠肾组织纤维化的作用,其机制可能与通过抑制TGF-β1表达和抑制Arkadia泛素化降解SnoN蛋白有关。