发酵法生产子囊霉素的研究进展

介绍了子囊霉素的结构特点和理化性质,分析了子囊霉素市场应用现状,着重论述了发酵法生产子囊霉素的研究进展,指出当前存在问题并对代谢工程在子囊霉素产生菌发酵中的应用进行概述,对今后的研究趋势进行了展望。

大环内酯类免疫抑制剂研究进展

大环内酯类免疫抑制剂是一组新的具有大环内酯结构的免疫抑制剂 ,经体内外研究证明具有明显的免疫抑制作用 ,其中包括他克莫司、子囊霉素及其衍生物SDZASM981、西罗莫司等 ,不仅可内服还可外用 ,故对一些皮肤病如异位性皮炎、银屑病、坏疽性脓皮病及扁平苔癣等均有效 ,本文综述其作用机制。

大环内酯类免疫抑制剂的研究进展

FK506结合蛋白12(FK506 binding protein12,FKBP12)是FK506结合蛋白的重要成员,目前对其参与免疫抑制剂抗器官移植后排斥反应的研究较多。他克莫司(FK506,tacrolimus)、雷帕霉素(rapamycin)和子囊霉素(ascomycin)是FKBP12的三个天然存在的大环内酯类配体,除了免疫抑制外还具有其他生理功能。这三个配体的衍生物也对FKBP12有一定的亲和力,且有些已经作为药物被应用于临床上。本文针对FKBP12的配体及其治疗作用进行综述。

子囊霉素产生菌营养生物合成和化学合成限定培养基的建立

目的建立新型免疫抑制剂子囊霉素产生菌吸水链霉菌FAC0329的化学合成限定培养基,为进一步研究子囊霉素产生菌的营养生物合成奠定基础。方法分别试验不同浓度的20种碳源,19种氨基酸和7种无机盐对子囊霉素产生菌FAC0329生长和子囊霉素生物合成的影响,应用建立的子囊霉素合成培养基研究了子囊霉素、FK506和雷帕霉素三个结构类似物的生物合成,表明该培养基的专一性。结果与结论研究了子囊霉素的营养生物合成,首次建立了适合子囊霉素产生菌的专一化学合成限定培养基,为进一步研究子囊霉素的生物合成,提高发酵生物效价提供必要条件。

他克莫司和子囊霉素电喷雾多级质谱负离子模式下的裂解分析

目的应用电喷雾多级质谱法分析他克莫司(FK506)和子囊霉素(FK520)在负离子模式下的特征碎片离子和裂解规律。方法采用电喷雾电离离子阱多级质谱,极性检出模式为负离子模式。结果获得他克莫司和子囊霉素在负离子模式下的质谱裂解规律。结论该质谱裂解规律可应用于他克莫司及其类似物的快速结构解析、定量分析和药动学研究。

响应面法优化子囊霉素发酵工艺

采用响应面法对子囊霉素的发酵培养基及发酵条件进行优化。通过Plackett-Burman设计(PBD)筛选影响子囊霉素产量的关键变量,通过最陡爬坡实验确定响应面分析中心点,再进一步通过中心组合设计(CCD)与响应面分析获得关键变量的最优值。结果表明,影响子囊霉素产量的关键变量糊精、黄豆粉和发酵时间的最优值分别为75 g·L^(-1)、28 g·L^(-1)、138 h,在此优化条件下子囊霉素产量可达743 mg·L^(-1),较优化前提高了46.8%。

吸水链霉菌FIM-38-24产子囊霉素的发酵条件优化

目的优化S.hygroscopicus FIM-38-24菌株产子囊霉素发酵条件。方法采用单因素试验和正交试验研究发酵培养基组成,探讨摇瓶发酵的主要影响因子初始p H值、装液量、转速等发酵参数的影响。结果确定了适宜发酵培养基和发酵参数:糊精4.5%,葡萄糖1.0%,黄豆粉3.0%,玉米浆粉0.5%,氯化钠0.2%,磷酸氢二钾0.1%,精氨酸0.25%,碳酸钙0.05%,莽草酸0.2%,初始p H 6.5,装液量60 m L/500 m L,种子菌龄59h,接种量10%,摇床转速250r·min-1,发酵温度28℃,发酵时间5d。优化后的发酵水平较原生产工艺提高50%以上。结论子囊霉素的优化发酵工艺为其工业化生产奠定了基础。

免疫抑制剂子囊霉素分离制备的研究

目的建立适合工业化生产的子囊霉素分离制备新工艺。方法通过考察p H对发酵液稳定性和固液分离的影响、筛选菌丝提取溶媒、萃取溶剂、脱色介质和结晶条件,结果优化了子囊霉素分离制备条件,并建立其中试制备新工艺。连续制备三批子囊霉素,其纯度均达96%以上,收率超过50%。结论新工艺操作简便,分离效果显著,适合于子囊霉素的工业化生产。

吡美莫司的合成和纯化工艺的研究

目的优化免疫抑制类药物吡美莫司的合成和纯化工艺。方法以子囊霉素为原料通过选择性的羟基酯化-氯化反应一锅法合成路线,再经过反相填料柱纯化后得到目标产物。结果目标产物经过红外光谱、核磁共振氢谱和质谱确认化学结构,总收率为50%,纯度为99%。结论经过该合成和纯化工艺,产品纯度高,且易于实现工业化。

N^+低能离子注入与亚硝酸钠复合诱变筛选子囊霉素高产菌株的研究

为了获得子囊霉素高产菌株,以链霉菌NJWGH1322为研究对象,利用N+低能离子注入、亚硝酸钠(NaNO2)进行诱变。试验确定了最佳诱变条件:离子注入诱变剂量为200×1014ions/cm2;NaNO2诱变时间为5min。之后通过结合2种诱变方式进行复合诱变,结果显示:复合诱变效果明显优于单因子诱变。试验最终筛选出1株产量突变提高43.1%的高产菌株,经5次传代试验表明该菌株遗传稳定性较好。

反相高效液相色谱法测定发酵液中子囊霉素含量

建立用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定发酵液中子囊霉素含量方法。采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,以V（乙腈）∶V（水）=70∶30为流动相,柱温40℃,流速1.0 mL/min,检测波长210 nm,进样量20μL。子囊霉素标准品质量浓度在0.02~2.0 mg/mL范围内线性关系良好,线性回归方程为ρ=0.003 88A-0.001 41,r=0.999 97。平均回收率为99.79%（n=9）,相对标准偏差（RSD）为0.45%。

子囊霉素的分离与鉴别

应用大孔吸附树脂柱层析的方法从他克莫司产生菌的发酵提取液中分离得到化合物FW99802,经重结晶后得到纯度大于98%的结晶性粉末。对其理化性质的研究及光谱分析结果表明它与子囊霉素同质。

子囊霉素工程菌的构建及初步发酵工艺优化

基于子囊霉素的生物合成途径和机制,根据生物合成基因簇序列设计引物,应用PCR扩增游动放线菌(Antinoplanes sp.)N902-109赖氨酸合成途径关键基因——天冬氨酸激酶/天冬氨酸半醛脱氢酶/磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(lysC/asd/ppc)基因,整合至子囊霉素产生菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中,成功构建了过表达lysC/asd/ppc基因的重组工程菌,命名为AS-07。将AS-07工程菌进行摇瓶发酵研究,结果表明,与野生菌相比,子囊霉素的产量提高了25%。通过初步优化摇瓶发酵工艺,AS-07工程菌与野生菌相比,子囊霉素的产量提高了85%。

微生物来源的免疫抑制剂生物合成基因簇的研究

微生物来源的免疫抑制剂因免疫抑制活性高,毒性及不良反应小而受到医药学研究及临床的日益关注。市场需求的增加带来了生产及临床上的诸多问题,对此类药物生物合成基因簇的研究是解决这些问题的创新性且具潜力的方法。本文综述目前临床用微生物来源的免疫抑制剂生物合成基因簇的研究价值及意义、研究历史、常用研究方法及应用前景。

HPLC-MS/MS法在骨髓移植患者他克莫司血药浓度测定中的应用

目的建立测定骨髓移植患者全血他克莫司(FK506)血药浓度的高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)法,探索HPLC-MS/MS法与羧基金属免疫分析(CMIA)法和化学发光微粒免疫(Elecsys)法在FK506血药浓度检测中的关系,为临床合理选用FK506血药浓度监测方法提供可靠依据。方法采用子囊霉素作内标,全血样品经合内标甲醇沉淀蛋白处理。色谱柱为Ultimate XB-C_(18),柱温65℃,流动相为含0.1 g/dl甲酸和2 mmol/IL乙酸铵的水和含0.1ml/dl甲酸的甲醇,梯度洗脱。质谱检测方式为电喷雾离子阱正离子模式,MRM扫描,监测FK506 m/z 821.5~768.5,子囊霉素m/z809.4~756.4。选取部分骨髓移植患者全血FK506样本,分别用HPLC-MS/MS法,CMIA法和Elecsys法进行检测,对各种检测方法所检测的FK506浓度值进行比较。结果建立的HPLC-MS/MS法检测FK506血药浓度在0.5~50 ng/ml范围内线性关系良好,Y=0.228X-0.003 08(r=0.999 0)。HPLC-MS/MS法与CMIA法和Elecsys法检测FK506血药浓度结果相关性较好,差异无统计学意义。结论建立了检测FK506血药浓度的HPLC-MS/MS法,该法可用于临床骨髓移植患者全血FK506浓度的监测。

不同HPLC-MS/MS法检测骨髓移植患者雷帕霉素血药浓度的相关性及意义

目的建立以雷帕霉素(RAP)稳定同位素(RAP-d_(3))为内标的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法,并与以子囊霉素为内标的HPLC-MS/MS法检测结果进行差异性分析。方法以RAP-d_(3)为内标,建立测定RAP血药浓度的HPLC-MS/MS法,并对其进行方法学性能验证。同时,收集服用RAP的骨髓移植患者送检血样173份,分别用以RAP-d_(3)和子囊霉素为内标的HPLC-MS/MS法测定全血RAP浓度,并对两种方法检测结果进行分析。结果建立的以RAP-d_(3)为内标的HPLC-MS/MS法,各方法学评价指标均符合要求。HPLC-MS/MS(RAP-d_(3))法和HPLC-MS/MS(子囊霉素)法检测结果均符合正态分布,且相关性较好(回归方程为Y=0.932 X+0.158,r^(2)=0.915),测定结果的均值分别为4.30 ng/mL和4.16 ng/mL,差异无统计学意义(t=2.127,P=0.35)。结论以RAP-d_(3)和子囊霉素为内标的两种HPLC-MS/MS法,其检测结果无差别,无须进行换算,可直接用于临床骨髓移植患者RAP血药浓度测定。

UV+ARTP复合诱变筛选子囊霉素高产菌株

采用紫外(UV)与常压室温等离子体(ARTP)复合诱变技术对子囊霉素产生菌吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus进行诱变处理,结合摇瓶发酵初筛和复筛,以HPLC法检测子囊霉素的含量,结果获得1株遗传性状良好的子囊霉素高产菌株S.hygroscopicus FIM-38-24,其产子囊霉素能力较出发菌株提高4倍以上,发酵单位达568.0μg/ml。

子囊霉素产生菌吸水链霉菌FIM260840基因转移系统的建立

目的:建立子囊霉素产生菌吸水链霉菌FIM260840的接合基因转移体系,以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。方法:以整合型质粒p SET152为出发质粒,通过接合转移构建并子囊霉素产生菌FIM260840的基因转移系统。结果:12.5μg/m L安普霉素可有效筛选接合子。经PCR验证,质粒成功整合到菌株FIM260840基因组DNA中,所获接合子的安普霉素抗性高达400μg/m L以上。接合子经多次传代后,导入的质粒p SET152仍稳定整合于接合子基因组DNA上。结论:建立了高效、简便的吸水链霉菌FIM260840的基因转移系统,为该菌的生物合成基因改造奠定了基础。

在吸水链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因提高子囊霉素产量

为了解决子囊霉素(1)发酵过程低溶氧的问题,本研究将透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb)整合至1生产菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中,构建工程菌SIPI-FK520-2,通过RT-PCR分析检测到了vgb基因的转录表达,进一步利用CO结合差光谱分析也证实了工程菌中透明颤菌血红蛋白(VHb)具有生物活性。最后在发酵罐进行该工程菌的发酵培养研究,结果表明,与野生菌相比,工程菌发酵过程溶氧水平明显改善,1产量提高了38%,达到1 269.7 mg/L。

产子囊霉素吸水链霉菌遗传操作系统的优化及调控基因的研究

吸水链霉菌所产的子囊霉素(1)在工业上具有重要的应用价值,但存在遗传操作效率低等问题。本研究以1生产菌株吸水链霉菌SFK-6-33为研究对象,考察了影响吸水链霉菌与大肠埃希菌ET12567接合转移效率的因素,优化了吸水链霉菌与大肠埃希菌的接合转移遗传操作系统。结果表明,优化后的接合转移效率由最初的9.25×10^(–7)增加至4.33×10^(–5)。此外,在此基础上对吸水链霉菌生产1的相关调控基因(fkbN、fkbR1、shyT4和shyT10)进行研究,初步发现调控基因fkbN、shyT4能够促进1的合成,而调控基因fkbR1、shyT10对1的生物合成有抑制作用。