IPTG诱导浓度、时间对AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大。最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大。

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDVVP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。

Asia-I口蹄疫病毒P1-2A基因真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

目的:构建含有Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因的真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并用pVAXⅠ-P1-2A免疫小鼠,评价其体液免疫和细胞免疫水平。方法:通过RT-PCR方法扩增得到含有FMDVP1-2A编码区的目的基因,并将其克隆到pMD18-T载体上。将pMD18-T-P1-2A和pVAXⅠ分别经EcoRⅤ和XbaⅠ双酶切后连接构建真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A。将酶切鉴定正确后的重组质粒转染HeLa细胞进行IFA检测。再进行小鼠血清特异性抗体试验、小鼠T淋巴细胞增殖试验和IFN-γ ELISPOT试验。结果:酶切结果与预期目的条带大小相符;荧光结果表明经pVAXⅠ-P1-2A转染的细胞有明显的黄绿色荧光,说明P1-2A基因在HeLa细胞中得到了表达;小鼠免疫结果表明,免疫的小鼠都产生了较强的体液免疫和细胞免疫,并且T淋巴细胞增殖数和产生IFN-γ的细胞数和对照组相比显著提高(P<0.05)。间接ELISA试验表明,在免疫第14天抗体水平比对照组明显增高(P<0.05)。结论:成功构建了真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并通过小鼠免疫试验发现重组质粒试验组能够诱导产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。

Asia1型口蹄疫病毒多表位基因的设计及其在毕赤酵母中的表达

为制备Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)特异性诊断抗原,根据国内Asia 1型FMDV流行毒株的序列,合成了2个FMDV流行毒株VP1基因的5个抗原表位。采用InsightⅡ软件进行蛋白空间构象模拟,证实设计的多表位分子结构符合要求。将合成的多表位基因按设计的酶切位点进行酶切连接,构建了Asia 1型FMDV VP1双拷贝基因重组质粒(pMD18-dVP1 Asia)。从该重组质粒获得dVP1 Asia基因,与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了重组表达质粒pPIC9K-dVP1 Asia。用BglⅡ将重组表达质粒线性化后,转化GS115酵母菌。经筛选、鉴定,成功获得了表达FMDV多表位VP1蛋白的阳性重组酵母菌。该阳性重组酵母菌经甲醇诱导,在培养液上清中可检测到目的蛋白。Western-blot结果显示,该蛋白能特异识别Asia 1型FMDV抗体,且具有很好的反应原性。

中欧班列高质量发展面临的问题和对策研究

为推动中欧班列由高速增长转入高质量发展,运用调查研究和文献分析等方法,在分析中欧班列运行状况及特征后,针对中欧班列发展面临的“国家重视、自身优势、双碳目标导向、恶性竞争、补贴减少”等机遇和挑战,研究提出多元化提升通道枢纽能力,积极拓展国际国内市场,整合资源实现合作共赢,完善相关政策、标准和规范,注重提高通关效率,加快推进信息化建设等对策建议。

塔吉克斯坦《亚洲之声》传播的中国形象

伴随各国对国家形象重视度愈益加深,传播学和国际关系学领域关注的热点也聚焦于国家形象上。文本选取塔吉克斯坦社会政治出版物中有重要影响力的报纸《亚洲之声》(Азия-плюс),采用内容分析和对比分析相结合的方法对2007年和2012年《亚洲之声》有关中国专题报道进行分析。结果表明,政治、经济、体育议题仍是关注焦点,报道的倾向性却从正面转向中性为主。总结报道倾向性转变的原因有助于解读中国在塔吉克斯坦平面媒体中国家形象的形成过程,从而达到塑造正面中国国家形象的目的。

口蹄疫病毒亚洲I型YNBS/58株P12A-3C转基因植物双元表达载体的构建

目的双元载体是目前转基因植物工程普遍应用的载体,本文将口蹄疫病毒P12A基因、3C基因串联,构建植物表达载体pBin-438P12A-3C。方法为便于实验操作,本试验采用先将基因片段P12A、3C构建到一个中间质粒pcDNA3.1(+)的策略,构建成pcDNA3.1(+)-P12A-3C。结果通过对构建好的pBin438-P12A-3C(Mini-Ti)重组质粒进行PCR鉴定和序列测定,证明中间表达载体构建成功。结论通过三亲杂交法将重组质粒载体pBin438-P12A-3C导入到农杆菌GV3101,通过抗性筛选、PCR鉴定和序列测定,证明构建成功,与农杆菌中的help-Ti质粒共同组成植物双元表达载体,为以后的植物转化奠定基础。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒双拷贝VP1基因的串联表达及其免疫原性

口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因含有T细胞和B细胞表位,是口蹄疫病毒的主要免疫原性基因。作者将亚洲Ⅰ型FMDV VP1基因首尾串联构建双拷贝的VP1基因(2VP1),实现双拷贝VP1基因的原核表达,表达的重组蛋白(GST2VP1)经Sephadex-G200分子筛层析纯化后,Western blot证实其有反应原性,动物试验表明重组蛋白在加强免疫后能够产生和灭活疫苗相当的ELISA抗体和中和抗体;本试验结果为亚洲Ⅰ型FMDV免疫原性研究及GST2VP1蛋白的进一步应用奠定了基础。

俄罗斯与亚太地区经济合作驶入快车道

苏联解体前夕开始关注与亚太国家的经济外交和贸易往来。独立后的俄罗斯更加注重发展与亚太国家的关系,20世纪90年代双方经济合作还处于起步阶段。进入新世纪后,俄与亚太国家的经济关系相对于前一个十年呈加速融合趋势,其与亚太国家经济关系相对于政治关系严重失衡的现象正在得到扭转。未来,俄罗斯与亚太地区经济合作将驶入快车道,一体化前景看好,主要发展方向是建立自由贸易区。

烟粉虱MEAM1隐种漆酶-1基因全长cDNA克隆、序列分析与组织表达

多酚氧化酶是多种刺吸式昆虫唾液中的关键酶类,可以通过干扰寄主植物正常的氧化还原反应来调控食物来源使其更有利于昆虫本身。昆虫体内的漆酶-1属于多酚氧化酶家族,被认为参与昆虫取食过程中的金属离子代谢、降解植物次生有毒物质以及免疫防御等生理活动。为研究漆酶-1基因在烟粉虱MEAM1隐种Bemisia tabaciMiddle East-Asia Minor1组织中的功能,利用RACE技术首次获得了烟粉虱MEAMI隐种漆酶-1(laccase-1,lac-1)基因的cDNA全长序列,命名为Btlac-1(GenBank登录号:JQ966215)。结果表明,该基因含有一个2733bp的开放阅读框,编码910个氨基酸,其编码产物含有3个Cu-oxidase功能域,属于蓝多铜氧化酶家族成员。同源性比较分析表明,Btlac-1与黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps和豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的lac-1编码的氨基酸序列一致性达58%。Btlac-1在不同组织和发育时期的转录表达分析表明,Btlac-1在烟粉虱MEAM1隐种中肠中的转录水平最高,显著高于头胸部和腹部组织中,且在各个发育时期均有表达,在成虫期的表达水平较高。该结果为进一步明确lac-1在烟粉虱取食过程的生理作用奠定基础,也为探讨刺吸式昆虫与植物相互作用机制提供理论依据。

“满铁”特快“亚细亚”号考

日俄战争后,日本在中国东北建立了“满铁”,作为殖民侵略东北的急先锋。“满铁”通过蚕食鲸吞的方式最终完全控制了东北的铁路体系,这为“亚细亚”号的研制和运行创造了条件。从1933年开始,“满铁”开始制定政策和预算,并派遣技术人员前往欧美学习相关造车技术,同时引进部分设施,最终于1934年11月1日首次运行“亚细亚”号。“亚细亚”号是日本对外宣传和美化侵略的招牌,也是助推日本对华殖民统治的有力工具,更是广大东北民众可望而不可即的街景。“亚细亚”号的运行加深了日本对中国东北的奴役,加重了东北人民的负担,主要扮演了一种助纣为虐的不光彩角色。

浅析“一带一路”与中国向西开放

向西开放,对打通中国与亚欧邻国贸易的快捷通道、促进贸易投资便利化、实现跨国产能合作与装备制造业升级、保障中国的能源通道的畅通具有现实意义。推进一带一路是十三五规划的重要内容,中国将通过共建"一带一路"推动区域合作,努力达成沿线国家战略互信、经贸合作、人文交流,最终会整合出一带一路沿线国家自贸区,这是中国向西开放的重大战略。

Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒的构建及表达

为了构建Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒,采用多表位基因串联策略,合成包括口蹄疫病毒T细胞和B细胞表位基因的基因片段F,该基因片段由结构蛋白VP1上的2个B细胞表位(VP1135-159aa、VP1194-211aa)基因、非结构蛋白3A和3D上的T细胞表位(3A21-35aa、3D795-803aa)基因组成。利用限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ将基因片段F克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切鉴定、序列分析正确后,利用LipofectamineTM2000将阳性重组质粒pc-F转染至BHK-21细胞。Western-blot和IFA分析结果显示,所表达的蛋白大小约25.4ku,能够与Asia 1型口蹄疫病毒标准兔抗血清发生特异性反应,证实所表达的蛋白具有较好的反应原性。结果表明,Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒pc-F构建成功,且能在BHK-21细胞中正确表达。

跨境铁路运输是否加快了中国向西开放?——基于城市—产品层面的经验证据

中欧班列和中亚班列作为“一带一路”倡议的旗舰型项目,在新冠疫情期间实现逆势增长,发挥了国际运输新动脉的作用。本文采用双重差分法和合成控制法,利用中欧班列和中亚班列开通这一准自然实验,检验了跨境铁路运输是否加快了中国向西开放。研究发现:首先,跨境铁路运输显著促进了中国对欧洲、中亚等国的出口贸易,加快了中国向西开放的步伐。其次,机制分析表明,中欧班列和中亚班列通过降低市场准入门槛减少了固定贸易成本,通过降低综合运输成本减少了可变贸易成本。再次,拓展分析表明,从班列类型看,相对于中亚班列,中欧班列对价值链产品的出口促进作用更强;从出口二元边际看,中欧班列对扩展边际的促进作用更强,而中亚班列对集约边际的促进作用更强。总之,进一步发挥跨境铁路运输等基础设施的作用对中国“稳外贸”至关重要。