Expression of soluble human tumor necrosis factor receptor Ⅰ in Aspergillus niger

The cDNA of soluble human tumor necrosis factor receptor I (sTNFRI) was inserted into fusion-protein expression plasmid pIGF of A. niger to construct fusion expression vector pHBC containing a KEX2 like protein processing site designed on the fusion position. Extracellular protease-deficient strain of A. niger 3.795-1-23 was transformed with pHBC. Positive clone was estimated by Southern hybridization. SDS-PAGE for protein produced by re-combinant strain showed the distinctive expression band. Western blotting indicated that the secreted protein had immunoactivity of sTNFRI.

黑曲霉尿苷/尿嘧啶营养缺陷型转化系统的构建及应用

黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的工业发酵菌株,它具有强大的蛋白分泌表达能力。为了提高黑曲霉遗传操作效率及优化重组菌株的筛选策略,构建以尿苷/尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的转化系统。利用CRISPR/Cas9技术实现pyrG基因的敲除,在含有尿嘧啶核苷和5-氟乳清酸(5-FOA)的抗性培养基中筛选表型正确的转化子。经基因组PCR验证,黑曲霉营养缺陷型菌株可稳定遗传。利用该转化系统可成功实现增强型绿色荧光蛋白在黑曲霉中的表达。通过结合增强型绿色荧光蛋白和流式细胞仪建立了黑曲霉转化子的高通量筛选模型。

黑曲霉固态发酵稻谷壳粉制备木聚糖酶活力饲料辅料研究

试验旨在获取具备木聚糖酶活性的发酵稻谷壳粉,以提高稻谷壳粉的饲用价值。试验用黑曲霉对稻谷壳粉进行固态发酵,以发酵产物中木聚糖酶活力为指标,采用单因素结合响应面法优化发酵条件并测量发酵产物营养物质的含量。结果显示,发酵基质质量为10 g、初始含水量为10.1 mL、添加1.0%的硫酸铵、培养温度为30.9℃、培养时间为3.1 d时,发酵产物中木聚糖酶活力最高,为135.643 U/mL,较优化前提高了3.6倍。在此条件下,发酵稻谷壳粉中粗蛋白和真蛋白含量均有提高,真蛋白的含量达12.35%,较发酵前提高了107.21%,粗纤维和粗脂肪含量有所降低,粗灰分含量提高。研究表明,发酵稻谷壳粉中木聚糖酶活力达到饲用标准,提高了蛋白质含量,可以作为辅料制备饲料。

固态发酵处理餐厨垃圾制备饲料的研究

餐厨垃圾易腐烂但有机物含量高,利用固态发酵技术可将其转化成蛋白饲料从而变废为宝。试验拟从几种食用酵母菌和霉菌中筛选出转化率最高的发酵菌种,通过考察这些菌种在发酵过程中总糖及还原糖的代谢消耗,结合发酵产物中粗蛋白质含量的检测,筛选出黑曲霉(Aspergillus niger)F3为最佳菌种。考察了黑曲霉的发酵条件,最优发酵条件为:发酵温度30℃,初始pH 5.3,NaCl添加浓度2.5%,此条件下发酵餐厨垃圾,所得产物粗蛋白质含量为31.53%,与发酵前相比提高22%,能满足蛋白质饲料的蛋白含量要求。

鲜苹果渣发酵生产饲料蛋白研究

采用混合培养法研究接菌、加氮对未灭菌和灭菌鲜苹果渣发酵生产饲料蛋白的影响。结果表明,1接菌后鲜苹果渣的纯蛋白含量显著提高,其中未灭菌鲜苹果渣接入黑曲霉UA8发酵后,纯蛋白含量较未接菌的增加了137.8%。2加氮处理后鲜苹果渣纯蛋白含量高于不加氮处理,其中未灭菌鲜苹果渣接入黑曲霉UA8后加氮发酵产物纯蛋白含量较不加氮对照增加了35.2%。3未灭菌鲜苹果渣发酵后纯蛋白含量高于灭菌处理,其中单菌有氮发酵处理中,接入黑曲霉UA8时纯蛋白含量分别为105.6和75.0g/kg,直接发酵较灭菌发酵纯蛋白增加了40.8%。4鲜苹果渣发酵后发酵产物回收率与其纯蛋白含量呈负相关,未灭菌鲜苹果渣发酵有氮和无氮处理中,接入黑曲霉UA8后,发酵产物纯蛋白含量分别为105.6和78.1g/kg,而其回收率分别为62.2%和81.0%。5不同pH时鲜苹果渣发酵产物纯蛋白含量呈pH4>pH6的趋势,未灭菌鲜苹果渣发酵中果渣酸度为pH4和pH6时,酵母菌发酵产物纯蛋白含量分别为101.2和75.9g/kg,果渣自然酸化使发酵产物纯蛋白增加了33.3%。

黑曲霉菌株6042饲用酸性蛋白酶的性质及其应用研究

对黑曲霉变异菌株６０４２产生的酸性蛋白酶的性质及其作饲料添加剂的应用研究表明：酶作用条件基本与动物消化道生理条件相适应，最适ｐＨ为３．０～３．５，最适温度为４０～５０℃。酶液在４０℃以下稳定，５０℃以上则不稳定，６０℃处理３０分钟基本失活。固体粗酶制品的稳定性较好，室温保存半年酶活仅损失１３．４％。在最佳作用条件下，对酵母和鱼粉具有明显的降解作用，氨基酸总量分别比对照增加８９．７％和６１．８％。将５０００ｕ／ｇ的饲用酸性蛋白酶制剂以０．１％添加于乳猪及仔猪饲料中，日增重和饲料转化率分别比对照提高７．７７％和４．７１％。

酸性木聚糖酶产生菌株的筛选和酶学性质分析

【目的】从自然环境筛选出可用于饲料工业加工用途的酸性木聚糖酶产生菌株。【方法】通过富集培养定向筛选技术,从土壤中分离获得18株产木聚糖酶菌株,挑选其中5株进行摇瓶发酵。对产酶最高的菌株S8-3进行初步鉴定,同时分析该菌株产生的木聚糖酶的酶学性质。【结果】经初步鉴定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger);该菌株发酵液的木聚糖酶活性高达628.43U·mL-1;木聚糖酶的最适作用温度为45℃,最适pH为4.5,在70℃保温30min后酶活力仍为60%以上,在pH3.0—7.0内稳定性较好。【结论】预期该菌株产的木聚糖酶具有用于饲料添加剂的潜力。

不同添加剂对饲用苎麻与麦麸混合青贮品质的影响

为了解决饲用苎麻(Boehmeria nivea L.)木质纤维素过多的问题,本试验设计了4个处理,在混合青贮(80%苎麻+18%麦麸+2%蔗糖)中分别添加不同的添加剂,各处理发酵30 d后开包取样分析各项指标。结果显示,4个处理组都显著提高了青贮中可溶性碳水化合物、干物质、粗蛋白和乳酸含量(P<0.05);都显著降低了乙酸含量、中性洗涤纤维含量、pH和氨态氮/总氮比值(P<0.05)。添加黑曲霉菌液处理组和添加黑曲霉菌液+纤维素酶处理组酸性洗涤纤维及酸性洗涤木质素降解效果明显优于另外两个处理组(P<0.05)。添加黑曲霉菌液可有效进行木质纤维素降解,提高青贮品质,并且节约成本,为最佳处理。

添加不同浓度黑曲霉菌液对饲用苎麻混合青贮品质影响

为了解决苎麻(Boehmeria nivea)木质纤维素含量过多的问题,本试验设计了4个处理,在每千克混合青贮(80%苎麻+18%麦麸+2%蔗糖)中添加不同浓度的黑曲霉(Aspergillus niger)菌液(添加50 mL黑曲霉菌液+150 mL无菌水为处理Ⅰ、添加100 mL黑曲霉菌液+100 mL无菌水为处理Ⅱ、添加150 mL黑曲霉菌液+50 mL无菌水为处理Ⅲ、添加200 mL黑曲霉菌液为处理Ⅳ、添加200 ml无菌水为对照组(CK)),发酵30 d后开包取样分析各项指标。结果显示,添加黑曲霉菌液显著提高了青贮中可溶性碳水化合物、干物质、乳酸和乙酸含量(P<0.05),显著降低了青贮中pH和氨态氮/总氮比值(P<0.05);处理Ⅱ、处理Ⅲ和处理Ⅳ组显著降低了青贮中中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维及酸性不溶木质素含量(P<0.05);对处理Ⅱ组样品进行酶活检测发现,随着发酵时间的延长,羧甲基纤维素酶、锰过氧化物酶、漆酶和木聚糖酶4种酶酶活都有不同程度降低。从节约成本角度考虑,处理Ⅱ组是进行木质纤维素降解、青贮品质提高的最佳处理。

植酸酶固体发酵工艺的研究

介绍了黑曲霉固体培养生产植酸酶的发酵工艺 ,研究了培养基氮源、pH值、含水量、发酵时间等因素对产酶的影响 。

黑曲霉pepB基因缺失菌株的构建及其功能分析

以黑曲霉 (Aspergillusniger)GICC2 773基因组DNA为模板 ,用PCR方法分别扩增pepB基因中的上游约 1 4kb和下游约 1 3kb两段DNA序列 ,将此两段序列按同一方向分别插入质粒pMW1中潮霉素抗性基因 (hph)表达单元的 5′和 3′端 ,构建成重组质粒pMW1 pepB ,用于通过同源重组靶向破坏基因组中的pepB基因。同源重组则采用原生质体 PEG方法 ,将酶切pMW1 pepB得到的线性片段转化A .nigerGICC2 773菌株 ,通过潮霉素选择平板得到 6 2个Hgy抗性转化子 ,然后采用PCR方法从这些抗性转化子中筛选到 1个由于同源重组产生的pepB基因缺失突变菌株pepB2 9。功能分析显示该突变株的酸性蛋白酶活性有明显下降 。

真菌嵌合体植酸酶的构建及其抗蛋白酶水解特性研究

在烟曲霉植酸酶（Afp）的基因上，通过PCR逐步将编码1—47、178—237及338—381多肽序列的DNA片段置换为黑曲霉NRRL3135植酸酶（Anp）中的对应片段，构建了3个嵌合体（嵌合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）基因，并在毕赤酵母中将其成功表达及纯化。所有的嵌合体和亲本植酸酶均能抵抗胃蛋白酶。在m（胰蛋白酶）／m（植酸酶）为0．1时，Anp完全失活；但Afp与所有嵌合体的活性仅损失13％-23％。胰蛋白酶水解产物的SDS—PAGE结果显示嵌合体Ⅱ与Ⅲ也能被胰蛋白酶严重水解，但非变性PAGE结果却表明它们在水解后仍能保持结构完整。嵌合体也具有一些与Anp及Alp相异的新pH曲线及耐热性。实验表明，通过替换基因片段改良真菌植酸酶可行。

葡萄糖酸钠生产厂黑曲霉菌渣的利用研究

对葡萄糖酸钠生产中残留的黑曲霉菌体废渣的营养成分进行了测定,结果表明:该菌渣含粗蛋白10.30%、粗脂肪3.89%、粗纤维14.46%、粗灰分21.00%、总糖32.56%,此外还含有丰富的Ca、P、Mg、Fe、K、Na等矿物元素,与常用的饲料原料进行比较,证明该菌渣可用作饲料原料。为进一步实现该菌渣的高值化综合利用,对从该菌渣中提取粗蛋白、壳聚糖、麦角甾醇等有用成分的工艺进行了研究,提取率分别达到10.84%、3.44%、0.81%,壳聚糖的脱乙酰度为72.95%。

玉米渣皮双菌种固态发酵生产细胞蛋白的研究

研究了培养条件对玉米渣皮在盘式固态发酵反应器中用 Aspergillus niger B1 1和Candida utilis ATCC92 56共培养生产细胞蛋白的影响 ,单因素试验的最佳条件为 :培养时间60 h,培养温度 3 2℃ ,通风量 1 .2 5m3/min/m3(WS) ,料层厚度 8cm。在此条件下 ,纤维素和半纤维素的降解率分别为 2 7.8%和 3 9.8% ,真蛋白增加量为 6.2 3 % ,干基中蛋白质含量由 6.2 9%提高到 2 1 .0 4 % ,必需氨基酸组成由 4 0 .97%提高到 4 8.56% ,且含有较高活力的纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶。

玉米芯固态发酵生产蛋白饲料的工艺研究

以固态发酵培养方式,通过正交试验对黑曲霉和啤酒酵母在玉米芯和豆粕上共发酵生产饲料蛋白的条件进行了研究。在质量分数为80%的玉米芯和质量分数为20%的麸皮混合物中,加入含(NH4)2SO4质量分数2%,MgSO4.7H2O质量分数0.05%,KH2PO4质量分数0.01%的营养液(液料质量比1∶1),初始pH值为5.5,接种黑曲霉,接种量为10%,温度30℃,浅盘培养。黑曲霉培养48 h后接种酵母,接种量为10%;黑曲霉培养72 h后添加豆粕,物料中豆粕的质量分数为20%,再发酵48 h。结果表明:产品粗蛋白质含量达26.1%,净蛋白质增量为12.9个百分点。产品富含小肽和氨基酸,蛋白质水解度为9.4%。

苹果渣发酵生产饲料蛋白质工艺研究

研究了以苹果渣为原料生产饲料蛋白质的工艺条件.结果表明,混合菌种发酵生产的蛋白质含量优于单菌发酵,加入氮源处理较无氮源处理的蛋白质含量高.合适的工艺条件:浆料比1.3:1、黑曲霉接种量2%、装料量25 g、自然pH值、发酵温度30～33℃、发酵周期5 d.发酵产品的真蛋白含量由4.75%提高到16.25%,粗脂肪和灰分含量也大幅提高,营养价值得到了全面改善.

苹果渣固态发酵生产饲料蛋白研究

采用黑曲霉为菌种,通过单因素试验,获得了苹果渣发酵的适宜工艺条件:尿素添加量为7%,料水比1∶1,温度30℃,发酵时间5d,接种量1%,pH值自然。在已确定的工艺条件的基础上,进行了工业化模拟试验。结果表明,当发酵料层厚度为5mm、动力通风时,发酵产物真蛋白含量达到14.09%,蛋白质含量明显提高。

苹果渣发酵生产饲料蛋白质的工艺研究

本文以富士苹果为原料制取苹果渣,利用黑曲霉和酵母菌单菌种或混合菌种发酵制备饲料蛋白质。黑曲霉发酵苹果干渣的最优发酵工艺条件是:尿素添加量为5%、水料比1∶1、温度30℃、发酵时间5d。黑曲霉和酵母菌混合菌种发酵的最优条件是:自然pH下,浆料比为1.3∶1、黑曲霉接种量为2%、装料量25g。无论是单菌种还是混合菌种发酵,饲料蛋白质含量均在30%以上,混合发酵含量更高。

饲用复合酶生产菌株的诱变选育

通过UV诱变复合酶产生菌黑曲霉筛选得到一突变株JW001,该菌株可同时发酵产生高活力的多酶系,其中纤维素酶和酸性蛋白酶活力分别为18 379 u/g和6 472 u/g,比出发菌株分别提高122%和92%.优化确定了曲盘固体发酵工艺,并进行了复合酶动物应用试验,试验表明黑曲霉JW001菌株发酵生产的饲用复合酶制剂对不同畜禽均有很好的饲喂效果.

黑曲霉6042液体发酵生产饲用复合酶的工艺研究

对适合固体培养的黑曲霉变异菌株６０４２进行液体深层发酵工艺研究结果，其优化工艺为，发酵培养基配方：豆粕粉４．５％，麸皮０．５％，ＮＨ４ＮＯ３０．５％，ＣａＣｌ２０．３％和适量１号产酶诱导物。初始ｐＨ５．０～５．５，种龄２４小时，接种量１０％，发酵温度２８℃，发酵周期７２小时。酸性蛋白酶产酶水平为２４００～２６００ｕ／ｍｌ，纤维素酶８００～９００ｕ／ｍｌ，果胶酶８５０～９５０ｕ／ｍｌ。该菌株经多次传代，产酶性能稳定。