拟南芥AtNUDT10启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成一对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT10上游非编码区,并与pBAR-GUS3相连构建了植物表达载体pNUDT10P-GUS,采用农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株2周幼苗进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3.5～4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明,已获得AtNUDT10启动子,该启动子为组成型表达的启动子,并且病原菌Pst.DC3000及Pst.DC3000AvrB对该启动子没有诱导作用。

梨小食心虫气味受体GmolOR10基因克隆及表达谱分析

为研究梨小食心虫Grapholita molesta Busck嗅觉通讯分子机制,本研究应用RT-PCR克隆获得了梨小食心虫气味受体基因GmolOR10的完整开放阅读框,并对其序列结构进行了相关生物信息学分析,最后采用实时荧光定量PCR对GmolOR10在梨小食心虫成虫不同组织(触角、头、胸、腹、足、翅)与不同发育阶段的表达模式进行了定量分析。结果表明,GmolOR10编码区长1 194 bp,编码397个氨基酸,等电点和相对分子量分别为8.57和46.14 kD,有7个跨膜结构域。多序列比对与系统发育树结果显示GmolOR10与卷蛾科苹果蠹蛾Cydia pomonella CpomOR18和山毛榉卷叶蛾Cydia fagiglandana CfagOR18的氨基酸序列一致性较高,分别为84.38%和83.38%。GmolOR10在雄成虫触角中表达量较高,极显著高于雌虫触角(P<0.01),在雌、雄成虫头部也有较高的表达量,在成虫其他组织表达量很低。不同发育阶段的表达谱显示,GmolOR10在梨小食心虫的不同发育阶段均有表达,在成虫期的表达量最高(在雌雄成虫中的表达量均呈现出随着日龄增加逐渐升高然后下降的趋势),在其他发育阶段的表达量相对较低。GmolOR10具有昆虫气味受体的结构特征,在雌、雄虫触角高表达,在各发育阶段均有表达,据此推测GmolOR10可能与梨小食心虫觅食、感受及识别性信息素的过程有关。

小鼠Lewis肺癌细胞Foxp3的表达对T淋巴细胞增殖的影响及机制

目的:检测小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞中Foxp3基因的表达,研究小鼠LLC细胞中Foxp3过表达对T淋巴细胞的增殖和TGF-β1和IL-10表达的影响,探讨LLC细胞中Foxp3的表达在肿瘤免疫逃逸中的作用及可能机制。方法:分别采用RT-PCR和免疫组化染色法检测LLC细胞中Foxp3的mRNA和蛋白表达。构建pcDNA3.1-Foxp3重组质粒,采用FuGENEHD瞬时转染LLC细胞,实验分3组:LLC组,pcDNA3.1-LLC组及pcDNA3.1-Foxp3-LLC组。RT-PCR和免疫组化方法分别检测转染48小时后Foxp3基因的表达,通过淋巴细胞转化试验检测Foxp3过表达对T淋巴细胞增殖的影响,RT-PCR和ELISA方法分别检测Foxp3过表达对TGF-β1和IL-10的mRNA表达及蛋白分泌的影响。结果:在LLC细胞中检测到Foxp3mRNA及蛋白的表达;瞬时转染48小时后pcDNA3.1-Foxp3-LLC组LLC细胞中Foxp3表达增高,与LLC组和pcDNA3.1-LLC组相比差异显著(P<0.01);pcDNA3.1-Foxp3-LLC组LLC细胞及培养上清对T淋巴细胞增殖的抑制率均明显高于LLC组和pcDNA3.1-LLC组(P<0.05);pcDNA3.1-Foxp3-LLC组TGF-β1、IL-10mRNA和蛋白的表达水平明显高于LLC组和pcDNA3.1-LLC组(P<0.05)。结论:LLC细胞表达Foxp3,Foxp3可能通过上调TGF-β1和IL-10的表达来抑制T淋巴细胞的增殖,进而参与肿瘤的免疫逃逸。

人IL-10基因的克隆表达及表达产物活性的初步鉴定

目的:构建含人IL-10全基因序列的原核表达载体,并进行表达及产物活性的鉴定。方法:利用RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2的总RNA中扩增IL-10的全长编码序列。编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体PET-28 a(+),构建IL-10基因的重组原核表达载体。在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白,表达产物采用Western blot和ELISA进行鉴定。结果:表达产物主要位于包涵体内。经Western blot分析和ELISA检测显示,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期的结果相符,有结合抗体活性。结论:成功地扩增人IL-10全基因序列,并构建了含该基因序列的原核表达载体,在大肠杆菌中高效表达的表达产物具有抗原活性,为下一步制备抗IL-10的单克隆抗体(mAb)提供了必要的前提。

猪白细胞介素-10的分子克隆与序列测定

从LPS活化的猪外周血单个核细胞 (PBMC)提取总RNA ,用RT_PCR方法扩增出猪白细胞介素_10 (IL_10 )的编码基因 ,将其连接到pUC18质粒上 ,然后进行BamHI和HindIII双酶切鉴定筛选阳性克隆 ,序列分析结果表明该基因开放阅读框由5 2 8个核苷酸组成 ,推测产生的编码产物由 175个氨基酸组成。猪IL_10基因与人、大鼠和小鼠基因序列的同源性分别为84%、79%和 79% ,与国外报道的猪IL_10基因序列完全一致 。

漾濞大泡核桃病程相关蛋白10基因JsPR10-1的克隆与表达分析

病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR)10的激活与积累在植物抗逆境胁迫中有非常重要的作用。根据漾濞大泡核桃(Juglans sigillata)编码PR10的EST(expressed sequence tag)序列设计引物,利用快速扩增c DNA末端技术,克隆得到PR10基因的全长c DNA序列,并命名为Js PR10-1。Js PR10-1全长c DNA为776 bp,含有483 bp的开放阅读框、74 bp 5'-非编码区以及219 bp 3'-非编码区,编码含有160个氨基酸的蛋白质。全长基因序列中含有1个124 bp的内含子。Js PR10-1编码的蛋白质与栎树(Quercus suber)、欧洲山毛榉(Fagus sylvatica)以及欧洲板栗(Castanea sativa)的PR10相似性较高,并且在PR10的系统进化树中与双子叶植物聚为一支。qRT-PCR分析结果表明,植物信号分子水杨酸、茉莉酸、乙烯以及过氧化氢处理均可诱导Js PR10-1表达。在接种胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)后,Js PR10-1的表达量迅速上升并在接种8 h时达到最大值,表明Js PR10-1参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应。本研究为揭示漾濞大泡核桃抗性机制奠定了理论依据。

麦洼牦牛TLR1～10基因克隆及分子生物学特征分析

本研究克隆了麦洼牦牛天然免疫受体1~10基因的编码区,利用生物信息学工具分析基因特点,荧光定量PCR测定TLRs基因在不同组织中的表达量。序列比较分析结果表明,麦洼牦牛TLR基因与其他物种在核苷酸水平及氨基酸水平上均表现出很高的保守性。遗传进化方面,麦洼牦牛TLRs与牛和绵羊TLRs遗传进化距离最近,并与人、马、鼠TLRs等形成哺乳动物的一个分支,与鸡则形成遗传距离较远的一个分支。同时我们在进行系统发育分析时发现,TLR1、TLR6先聚为一小支,再与TLR10又聚为更紧密的一支,然后TLR1、2、6、10和TLR7、8、9分别聚集在两个单个的分支上,TLR其他成员各自成为一支。荧光定量结果表明,TLRs在麦洼牦牛各组织均有表达,但不同成员在不同组织的表达存在较大的差异。其中TLR2、TLR4和TLR6在脾表达量最高,在卵巢、小肠、肾、肝中有高表达,TLR1、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10在肾表达量最高,在肝、肾、脾等组织中高表达。综上所述,本研究的开展能为以后揭示TLRs在牦牛等高原模式动物分子免疫机制以及牦牛抗病育种奠定基础。

大鼠γ-干扰素诱导蛋白-10在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的原核表达大鼠γ干扰素诱导蛋白10,并对其进行鉴定。方法从大鼠脾细胞中提取RNA,用RTPCR方法得到IP10cDNA,双酶切将其插入pET32a(+)载体中。重组质粒pET32a(+)IP10经酶切、PCR及测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。结果所获得的大鼠IP10克隆,经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDSPAGE和Westernblot分析获得证实。结论已成功构建原核表达载体pET32a(+)IP10,并使其在大肠杆菌中获得了融合表达。

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10 cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10 cDNA共1 117 bp,包含55 bp的5'端非编码区,一个540 bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522 bp的3'端非编码区,其中,3'非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。

牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析

根据GenBank上牛分枝杆菌(M.bovis)CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100%。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。

广西巴马小型猪IL-4和IL-10基因的克隆和序列分析

为研究猪白细胞介素4(IL-4)和白细胞介素10(IL-10)在机体免疫应答中的作用,从ConA刺激的巴马小型猪的外周血淋巴细胞提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出IL-4和IL-10基因,将其分别克隆到PMD18-T 载体上,进行序列分析.结果表明,克隆的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列与GenBank上登录的其它猪种的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%～100%、97.0%～99.3%和99.2%、97.7%.

人白细胞介素10（hIL－10）基因的克隆和序列测定

应用逆转录多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，自行设计并合成一对引物，成功地从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ基因。并定向插入ｐＵＣ１８载体中，经ＤＮＡ序列测定最终确定为ｈｌＬ－１０ｃＤＮＡ基困，这将为令后ｈＩＬ－１０基因探针的制备和基因表达，进一步在基因水平上探讨ｈＩＬ－１０的生物学功能提供了物质基础。

荣昌猪白细胞介素-10(IL-10)基因的克隆及原核表达

根据GenBank收录的猪白细胞介素-10(PIL-10)设计1对特异性引物,经刀豆蛋白素A(conA)诱导猪淋巴细胞并提取总RNA,RT-PCR方法首次扩增出荣昌猪PIL-10的全长基因。序列分析表明PIL-10全长771 bp。设计1对引物亚克隆荣昌猪IL-10基因成熟蛋白编码基因(477 bp)。利用基因重组技术构建了PET32a(+)-PIL-10融合表达载体,经酶切鉴定,DNA测序证实重组质粒构建正确。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,SDS-PAGE,重组菌的RT-PCR,Western blotting结果表明融合表达成功。

易变山羊草抗禾谷孢囊线虫基因中核苷酸结合位点区(NBS)的克隆及序列分析

大部分已克隆的植物抗病基因都包含有核苷酸结合位点区 (NBS)和富含亮氨酸的重复序列区 (LRR) .利用来自节节麦的抗禾谷孢囊线虫基因Cre3位点NBS区保守序列设计特异引物 ,从含有来自易变山羊草的抗禾谷孢囊线虫基因的小麦品系E 10的基因组中PCR扩增得到一条约 5 30bp的单一条带 .将扩增条带克隆和序列分析发现 ,该克隆 (Rccn4 )的编码区长 5 2 8bp ,含一个不完整的开放读码框 ,没有起始密码子、终止密码子和内含子结构 ,它编码一个 176个氨基酸残基的蛋白质 ,分子量为 2 0 4kD .Rccn4含有NBS LRR类抗病基因NBS区共有的保守模体I(V)LDD、T(T S)R、G(L S)PLA(A I L)、RCF(A L)Y ,并且与Cre3基因的NBS编码区核苷酸和氨基酸同源性分别为99 4 %和 98% .

南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析

对中国重要药用植物南方红豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因进行分离、测序以及生物信息学分析。根据GenBank中已登录的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了1个DBAT基因Tc-DBAT的全长cDNA。结果显示,Tc-DBAT cDNA含有1个1 323 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码440个氨基酸,对应基因组序列含有1个内含子。Tc-DBAT蛋白N端含有5个N-酰基化作用位点和2个保守的N-糖基化作用位点,具有1个保守的B ig-1结构域,多个重要的磷酸化位点以及1个类似钙结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明,Tc-DBAT属于转移酶超家族(transferase superfamily),是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白,能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)10位的乙酰化,从而生成抗癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体——巴卡亭Ⅲ。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因达到提高其半合成前体巴卡亭Ⅲ产量的目的,并且为进一步利用组合表达系统商业化生产紫杉醇奠定基础。

人白细胞介素10真核表达载体的构建及表达

目的 建立人白细胞介素 10 (h IL - 10 )真核表达系统并观察其在 He L a细胞中的表达。方法 用RT- PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增 h IL - 10 c DNA,将其克隆至 p MD18- T中 ,测序正确后 ,再定向插入真核表达载体 p CIneo中 ,经脂质体介导转染 He L a细胞 ,检测其在细胞内外的表达和分泌。结果 RT- PCR扩增的 h IL - 10 c DNA序列与 Gen Bank中 h IL - 10 c DNA序列一致 ;构建了真核重组表达载体 p CIneo- h IL - 10 ;转染He L a细胞后可检测到 h IL - 10的转录和表达。结论 成功构建了 h IL - 10真核表达系统 ,为今后的临床研究及基因工程药物的生产奠定基础。

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的:克隆编码人白细胞介素10(hIL-10)基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达。方法:应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体。采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑(MTT)检测hIL-10蛋白的活性。结果:RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功。在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化。结论:成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础。

人白细胞介素10的克隆及分泌表达

目的 :研究人白细胞介素 10 (hIL -10 )的高效分泌表达。方法 :根据Genbank报道的hIL -10基因序列 ,人工合成hIL -10基因 ,并将某些稀有密码子替换成E .Coli偏爱密码子 ,克隆至 pUC18质粒中 ,测序结果与预期一致。将hIL -10基因克隆至PET2 2b ,构建分泌表达克隆PET2 2b -hIL -10 ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中表达hIL -10天然蛋白。结果 :SDS -PGAE电泳及凝胶密度扫描分析显示 ,重组蛋白分子量约为 18KD和 2 1KD(含信号肽 ) ,不同温度条件下重组蛋白的表达状态和表达量不同。结论 :18℃重组蛋白hIL -10的表达量为 7.6%。

人IL-10 cDNA克隆、表达及其生物学活性

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10(Human Interleukin,hIL-10)。方法 用RT-PCR自白血病细胞株K562 RNA扩增hIL-10 cDNA片段(约500bp),克隆至质粒载体pSK(+),并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRI和 BamHI消化pSK/IL-10重组质粒,分离hIL-10片段,并插入原核表达载体pBV220的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pBV/IL-10。转化菌株经42℃诱导,用SDS-PAGE和Westem blot鉴定表达的重组蛋白。表达的重组蛋白经谷胱甘肽复性缓冲液复性,用RT-PCR检测其对外周血单核细胞(PBMC)合成IFN-γ的抑制作用。结果 RT-PCR扩增的DNA片段与hIL-10 cDNA大小一致。重组质粒pSK/IL-10的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hIL-10 cDNA序列一致。SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为18000,其表达量达菌体总蛋白的20％左右。Westem blot分析显示,重组蛋白能特异性地与抗hIL-10抗体结合,复性的重组蛋白能明显抑制PBMC合成IFN-γ。结论 已成功地构建了表达具有生物学活性的重组hIL-10(Recombinant hIL-10,rhIL-10)的工程菌株。

人热休克蛋白10和鼠热休克蛋白10的克隆、序列分析及其原核表达

提取人肝癌SMMC-7721细胞和小鼠NS0细胞总RNA,对热休克蛋白10基因(Hsp10)进行RT-PCR扩增、TA克隆和测序。结果表明,从上述2种细胞中获得的cDNA分别由312,313 bp组成,与报道的人HSPE1 mRNA(NM-002157)、鼠肌肉Hspe1 mRNA(NM-008303)序列同源性分别为99%,97%,命名为HSPE1-1和Hspe1-1,序列分析表明,二者之间在核苷酸水平上的同源性为92%,氨基酸水平上的同源性为97%。将上述2种cDNA进行双酶切、亚克隆,成功构建了重组表达载体pET-28a-HSPE1-1与pET-28a-Hspe1-1,转化大肠杆菌并进行了诱导表达。检测结果表明,pET-28a-HSPE1-1与pET-28a-Hspe1-1均能在大肠杆菌中表达,表达蛋白分子量大小约为14 kDa,与预期大小一致。Western-Blot结果证实了其为目的蛋白,经镍树脂柱纯化,获得了相应的重组蛋白。为进一步研究这2种蛋白的结构、功能及临床应用奠定了基础。