顺式串联家蝇抗菌肽Attacin基因真核表达载体的构建

目的构建家蝇抗菌肽Attacin基因多拷贝串联体,并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上。方法PCR法扩增家蝇抗菌肽Attacin基因成熟肽片断,目的片断的上游5′端带有EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ位点,下游5′端带有NotⅠ和xbaⅠ位点,目的片断首先克隆入pMD18-T栽体,利用pMD18-T载体的Nde Ⅰ位点和目的片断上的一对同尾酶(Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ),多次酶切连接,串联成多拷贝的Attacin成熟肽基因,再用EcoRⅠ和Not Ⅰ双酶切,最后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K。结果 PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明串联体基因重组质粒构建成功。结论该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步进行高效表达打下基础。