西达本胺对人B淋巴瘤细胞株的作用及其机制研究

本研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)西达本胺对3种B淋巴瘤细胞株Raji(Burkitt淋巴瘤)、Maver及Z-138(套细胞淋巴瘤)的抑制增殖和诱导凋亡的作用及其机制。以不同浓度的西达本胺及不同时间作用于体外培养的3种B淋巴瘤细胞,采用CCK-8法检测细胞的增殖;流式细胞术检测细胞的凋亡及线粒体膜电位;Western blot方法检测细胞内组蛋白H3、H4乙酰化水平及caspase-3蛋白的表达。结果表明,西达本胺可抑制这3种B淋巴瘤细胞的增殖,其抑制作用具有一定的时间和浓度依赖性,尤其能较早较快地抑制Z-138细胞的增殖;另外,西达本胺还可诱导3种B淋巴瘤细胞发生凋亡并引起细胞线粒体膜电位下降,Maver及Z-138细胞对西达本胺较Raji细胞更为敏感;西达本胺可以提高细胞内组蛋白H3、H4乙酰化水平及Maver和Z-138细胞的caspase-3活性。结论:西达本胺能够抑制B淋巴瘤细胞株的增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与西达本胺上调组蛋白H3、H4乙酰化水平,触发线粒体凋亡途径及活化caspase-3有关。

雄黄诱导人弥漫性大B淋巴瘤SU-DHL-4细胞凋亡及其机制的初步研究

本研究旨在探讨雄黄(Realgar,As4S4)诱导人弥漫性大B淋巴瘤SU-DHL-4细胞凋亡及其可能的机制。采用MTT法观测雄黄对SU-DHL-4细胞的增殖抑制作用,应用流式细胞术检测药物对SU-DHL-4细胞周期的影响及其诱导凋亡情况,利用琼脂糖凝胶电泳方法观察凋亡细胞的DNA降解情况,通过透射电子显微镜技术观察药物作用前后细胞超微结构的变化,采用Western blot方法检测药物诱导SU-DHL-4细胞48 h后Caspase-3、Bcl-2以及Bax蛋白表达情况。结果表明:20、40、80μmol/L的雄黄均可抑制SU-DHL-4细胞增殖,抑制率呈时间-剂量依赖性(r=0.982;P<0.05);AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率显示雄黄作用SU-DHL-4细胞48 h后,随着药物浓度的增加,早期凋亡细胞所占比率增高(P<0.05);PI单染流式细胞术检测细胞周期发现,雄黄作用SU-DHL-4细胞48 h后处于细胞周期S期的细胞显著减少(P<0.05);透射电子显微镜下观察雄黄作用SU-DHL-4细胞48 h后各浓度组细胞,均呈典型凋亡的改变,偶见坏死细胞;琼脂糖凝胶电泳结果显示,各浓度实验组雄黄干预SU-DHL-4细胞48 h后,细胞核DNA降解呈梯状;Western blot结果显示,雄黄作用SU-DHL-4细胞48 h后,Bcl-2蛋白表达降低,Bax和Caspase-3蛋白表达增加。结论:雄黄可以诱导人弥漫性大B淋巴瘤细胞凋亡,其作用机制可能是通过抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、上调Caspase-3和Bax蛋白,下调Bcl-2蛋白而诱导细胞凋亡。

类似人弥漫型大B细胞淋巴瘤小鼠模型的免疫学特征

本研究建立类似人弥漫型大B细胞淋巴瘤的BALB/c小鼠模型并探索其免疫学特征。将鼠源性B淋巴瘤细胞株(A20细胞)接种于同源BALB/c小鼠以建立B细胞淋巴瘤鼠模型。实验分为3组:成瘤小鼠组,未成瘤小鼠组和正常小鼠组(对照组)。用流式细胞术检测肿瘤细胞CD抗原表达及成瘤小鼠、未成瘤小鼠和对照正常小鼠的外周血和脾脏的T/B淋巴细胞亚群比例。结果表明:在成功构建病理学形态类似人弥漫大B细胞淋巴瘤的BALB/c鼠模型肿瘤组织中,检测到CD3、CD4、CD8、CD19、CD30阳性细胞的比例分别为(49.27±23.75)%,(6.07±3.65)%,(51.2±23.1)%,(67.06±16.39)%,(37.93±17.03)%,与接种前A20细胞相比,其CD3和CD8阳性细胞比例显著升高,CD19阳性表达比例显著下降(p<0.05)。成瘤小鼠外周血淋巴细胞亚群阳性表达比例较正常小鼠有显著差异,其CD3和CD4阳性细胞比例显著降低(p<0.05)。未成瘤小鼠脾脏淋巴细胞亚群的阳性表达比例与正常小鼠相比,CD3、CD4、CD8阳性细胞比例降低,而CD19阳性细胞比例升高(p<0.05)。结论:本研究为在有免疫功能的小鼠体内进行B细胞淋巴瘤相关研究提供了免疫相关实验依据。

荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型的建立

目的:建立荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为后期异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用的研究提供实验工具。方法:将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入A20鼠B细胞淋巴瘤细胞株,建立稳定表达荧光素酶的A20细胞株;将其与C57BL/6小鼠骨髓经尾静脉共同接种于辐射后的BALB/c小鼠体内,建立移植肿瘤模型;用活体荧光成像系统检测肿瘤的发生发展,并观察小鼠的活存,体重变化以及成瘤部位;取肿瘤组织和动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色观察其组织学特点。结果:经慢病毒转染和嘌呤霉素筛选获得了稳定表达荧光素酶基因的A20细胞株。活体荧光成像观察发现,在A20细胞接种第8天,即可观察到肿瘤发光,随着观察天数的增加荧光强度增强。相比较于骨髓移植(BMT)组,BMT+A2 0-Luc^+组小鼠存活率下降,体重降低明显。大体解剖显示,成瘤部位主要波及肝脏和脾脏,成瘤组织特征类似人弥漫大B细胞淋巴瘤。结论:成功构建了荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为探讨异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用提供了研究平台。

播散性鼠B细胞淋巴瘤动物模型的建立

目的在具有免疫能力的BALB／c小鼠上构建播散性B淋巴瘤动物模型。方法经尾静脉注射鼠源性B细胞淋巴瘤细胞株A20于同源BALB／c小鼠，0～3个月间观察动物成瘤情况；取动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色；流式细胞仪检测其CD19的表达。结果尾静脉注射2×10^6、2×10^7细胞于14只BALB／c小鼠，成瘤时间分别为76．8±12．0天和26.1±7．9天；总体成瘤率分别为71.4％（5／7）和100％（7／7）；在肝脏、脾脏、淋巴结、肠、肠系膜、下肢、颈部、子宫和臀部等多脏器成瘤；流式检测瘤组织细胞mCD19表达强阳性。结论运用尾静脉注射方法构建了内脏器官广泛发生的播散性B淋巴瘤BALB／c小鼠动物模型，为进一步进行B淋巴瘤相关研究提供了实验依据。

不同方式构建A20鼠B细胞淋巴瘤动物模型

目的探索多种方式构建A20鼠B细胞淋巴瘤动物模型及不同方式造模成瘤的特征。方法鼠源性B细胞淋巴瘤细胞株A20经皮下、尾静脉、脾脏和腹腔接种于同源BALB/c小鼠或先接种裸鼠成瘤后组织块移植BALB/c小鼠,观察动物成瘤时间、成瘤率、成瘤部位;取肿瘤组织和动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色观察其组织学特点。结果BALB/c鼠皮下注2×106组、2×107组和裸鼠瘤组织移植BALB/c小鼠组成瘤率皆为100%,成瘤时间分别为(15.29±3.2)d(、7.0±0.82)d和(6.29±0.49)d。BALB/c小鼠尾静脉注射2×106组、2×107组、脾脏注射组、腹腔注射组成瘤率分别为71.4%、100%、71.4%、14.3%,成瘤时间分别为(76.8±12.0)d、(26.1±7.99)d、(32.6±5.99)d和27 d。尾静脉成瘤部位播及肝脏、脾脏、胰腺、肾脏、食道、胃、肠、肠系膜、脑、淋巴结、骨、子宫、肌肉等多脏器和组织。BALB/c鼠A20成瘤组织学类似人弥漫大B细胞淋巴瘤。结论成功构建A20皮下移植瘤模型、血行播散性模型,为利用有免疫功能动物进行B淋巴瘤相关研究提供了实验平台。

AMD3100联合利妥昔单抗对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株SU-DHL-2的影响及机制研究

目的探讨AMD3100、利妥昔单抗(Rituximab)对人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株SU-DHL-2增殖、凋亡与侵袭能力的影响及其分子机制。方法对弥漫大B细胞淋巴瘤SU-DHL-2细胞株进行体外培养,将对数生长期细胞分为对照组(未经任何处理)、AMD3100组(加入1μmol/L AMD3100)、Rituximab组(加入10μg/mLRituximab)、联合用药组(加入1μmol/LAMD3100,孵育1 h后加入10μg/mLRituximab)。采用细胞计数(Cellcountingkit-8,CCK-8)增殖实验检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡、Transwell小室检测细胞迁移和侵袭、Westernblot法检测SU-DHL-2细胞株中趋化因子受体4(CXCR4)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白质表达情况及外源性AMD3100、Rituximab及联合用药后蛋白质表达水平的变化。结果细胞增殖实验结果显示,AMD3100组、Rituximab组均可显著抑制SU-DHL-2细胞株的增殖,差异具有统计学意义(P<0.05)。联合用药组具有协同作用,使用后细胞存活率(59.431%)显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。细胞凋亡实验结果显示,AMD1300组、Rituximab组与对照组比较,联合用药组与AMD3100组、Rituximab组与对照组比较,细胞凋亡率显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,对照组穿膜相对细胞数(100.000±0.526、100.000±0.432)高于AMD3100组(85.253±0.530、86.943±0.592)、Rituximab组(79.743±0.531、81.073±0.433)、联合用药组(61.860±0.526、63.477±0.592),各组间比较差异具有统计学意义(P均<0.01)。Westernblot结果显示,AMD3100组、Rituximab组CXCR4、AKT、p-AKT、MMP-9、MMP-2表达水平降低,联合用药后作用增强,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论AMD3100与Rituximab可能通过调节MMP-9、MMP-2及AKT信号通路,对SU-DHL-2细胞株的增殖、促进、迁移和侵袭起调节作用,并具有协同效应。

2,3,7,8-TCDD对B淋巴瘤细胞株CH12.LX抗体分泌功能的毒性效应及机制研究

目的探讨2,3,7,8-四氯二苯-对-二噁英(TCDD)对B淋巴细胞株CH12.LX的抗体分泌功能的毒性效应,及其可能的受体机制。方法以B淋巴细胞株CH12.LX为细胞模型,以ELISA法检测系列浓度TCDD处理对LPS活化CH12.LX的IgM分泌功能的影响,以RT-PCR和Western blot法检测CH12.LX细胞内芳香烃受体(AhR)的表达水平,以及TCDD对细胞色素P450Cyp1a1的诱导效应。结果较低浓度的TCDD(0.03nmol/L)即对CH12.LX的IgM分泌能力产生了显著的抑制效应(P<0·05),同时TCDD(10nmol/L)可显著诱导CH12.LX细胞内Cyp1a1 mRNA的表达(P<0·05),并于CH12.LX细胞内发现AhR有一定水平的表达。结论TCDD对B淋巴细胞株CH12.LX存在显著的抗体分泌抑制效应;同时,推测TCDD的这一免疫毒性效应主要可能由AhR介导。

小鼠B淋巴瘤细胞系A20核转染的影响因素分析

目的分析影响小鼠B淋巴瘤细胞系A20的核转染效率的因素,以提高转染效率。方法2017年1-6月在武汉大学人民医院中心实验室和肾病实验实进行实验。以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,使用Nucleofector核酸转染方法分别转染4种外源基因即CD40、ARNO、C-ABL JLP进入A20细胞,用流式细胞术和荧光显微镜分别检测转染效率,研究细胞转染时间和外源质粒大小对核转染效率的影响。结果质粒大小在8 kb以下时转染效率均很高,质粒超过8 kb时转染效率较低,其中,ARNO组(目的基因长度为1 366 bp)转染效率最高,JLP组(目的基因长度为3 976 bp)转染效率最低,转染后4 h检测转染效率最高,48 h时最低。结论核转染方法非常适合于悬浮细胞的转染。且相对于传统的脂质体转染等方式,核转染的方法能有效缩短转染时间。外源基因过大会导致转染效率低,控制外源基因的大小能有效提高转染效率。

表观遗传学药物对弥漫大B细胞淋巴瘤SU-DHL-4细胞株增殖及SHP-1基因表达的影响

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)及组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(N-Hydroxy-N-phenyloctanediamide,SAHA)对弥漫大B细胞淋巴瘤SU-DHL-4细胞株增殖及抑癌基因蛋白酪氨酸磷酸酶-1基因(Src-homologydomain2-containingprotein tyrosine phosphatase-1,SHP-1)表达的影响。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测5-Aza-CdR及SAHA对SU-DHL-4细胞株增殖的影响,SYBR Green相对定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测SHP-1基因表达水平。结果5-Aza-CdR及SAHA均可抑制SU-DHL-4细胞的增殖,且表现为浓度依赖性;1μmol/L5-Aza-CdR及2μmol/SAHA联合应用后,SU-DHL-4细胞的增殖抑制率增高为52.23%,且不同药物浓度间吸光度比较(P<0.01);5-Aza-CdR及SAHA均能使SU-DHL-4细胞中SHP-1重新表达,且联合应用后表达量更高。结论表观遗传学药物能显著抑制弥漫大B细胞淋巴瘤SU-DHL-4细胞株增殖,可能与其诱导的SHP-1基因的表观遗传改变和SHP-1的再表达有关。

人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体构建及其稳定表达细胞株的筛选

构建并鉴定人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体,筛选CARABIN过表达的弥散性大B淋巴瘤细胞SUDHL-6的稳定细胞株。通过设计Carabin上下游引物,用同源重组的方法构建慢病毒载体pLENTI-c GFP-CARABIN,将其与psPAX2和pMD2.G包装质粒按3∶2∶1的比例用PEI Transfection Reagent共转染HEK293T细胞制备病毒,用病毒颗粒感染SU-DHL-6细胞2周后,用流式细胞仪分选GFP表达阳性的细胞,Western Blot检测CARABIN-GFP融合蛋白表达。成功构建pLENTI-c GFP-CARABIN慢病毒过表达载体。包装病毒颗粒并感染SU-DHL-6细胞后,荧光显微镜检测和流式细胞分选鉴定表达效率为26.5%,筛选出的GFP阳性细胞用Western Blot检测到CARABINGFP融合蛋白表达。成功构建了Carabin过表达慢病毒载体并筛选出了CARABIN-GFP稳定表达的细胞株。

Laptm5 3'UTR对小鼠B细胞淋巴瘤38B9细胞增殖与凋亡的影响

目的:通过建立稳定过表达溶酶体相关穿膜蛋白5(lysosomal associated protein transmembrane 5,Laptm5)3'不翻译区(3'UTR)的B细胞淋巴瘤38B9细胞株,探讨Laptm5 3'UTR对小鼠B细胞淋巴瘤38B9细胞株增殖、凋亡的影响。方法:荧光定量PCR及Western blotting检测小鼠B细胞及38B9细胞中Laptm5 miRNA及其蛋白质的表达水平;将小鼠Laptm5 3'UTR及其含有的microRNA结合位点突变的突变型基因片段构建入逆转录病毒表达载体p MSCV-PIG,包装成逆转录病毒,感染小鼠B细胞淋巴瘤细胞38B9,流式细胞术检测逆转录病毒感染率,细胞计数法及流式细胞术观察Laptm5 3'UTR或其突变型过表达后389B9细胞的增殖、凋亡情况。结果:相比小鼠B细胞,B细胞淋巴瘤细胞中Laptm5的miRNA及蛋白均显著降低(P<0.01)。成功获得稳定过表达Laptm5 3'UTR(突变型)的38B9细胞株。Laptm5 3'UTR细胞株比Laptm5 3'UTR突变型过表达细胞株的增殖能力显著减慢,凋亡率显著增加[(7.87±1.08)%vs(0.45±0.07)%,P<0.01]。结论:小鼠Laptm53'UTR具有抑制B细胞淋巴瘤增殖、促进其凋亡的作用,该作用可能与其影响相关microRNA的调控有关。

眼眶弥漫大B细胞淋巴瘤裸鼠模型的建立

背景近年来眼眶淋巴瘤的发病率逐渐升高，在病理特点、治疗方法以及发病机制方面的研究不断深入。由于眼眶淋巴瘤发病率低，体外培养困难，眼眶淋巴瘤裸鼠模型研究的报道较少。目的应用细胞系pfeiffer建立弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）眼眶裸鼠模型，比较小鼠淋巴瘤模型与人眼眶DLBCL病理标本的病理学特点及生物学行为，探讨全身DLBCL细胞系pfeiffer用于眼眶淋巴瘤研究的可能性。方法选用SPF级BALB／c裸鼠10只和nod—SCID小鼠5只，先用137Cs对BALB／c裸鼠（吸收剂量为3．5Gy）和nod—SCID小鼠（吸收剂量为2．6Gy）进行照射，照射后6h内分别进行小鼠眼眶内（BALB／c小鼠4只眼）及皮下注射（BALB／c小鼠和nod—SCID小鼠各4只眼）pfeiffer细胞，接种细胞密度约为1．5×10^8／ml，即眼眶接种组和皮下接种组。注射后每日观察肿瘤的生长状态，并绘制肿瘤生长曲线。于注射后54d无菌条件下完整取出小鼠眼眶肿瘤和皮下肿瘤及附近淋巴结，制备4μm厚组织切片。采用苏木精一伊红染色评估肿瘤的组织病理学特点，采用免疫组织化学法检测模型肿瘤切片中CD20、CD79α、CD45RO蛋白的表达，并根据CD10、BCL-6和mum-1的表达进行分型，依据Ki-67及survivin的表达判断肿瘤的预后，并将模型小鼠的检测结果与人眼眶DLBCL病理标本的特点进行比较。结果眼眶接种组和皮下接种组成瘤率均为100％，nod-SCID小鼠的肿瘤生长速度快于BALB／c裸鼠。组织病理学检查可见眼眶接种组小鼠邻近淋巴结无肿瘤细胞浸润，皮下接种组小鼠腋窝淋巴结少量肿瘤细胞浸润。苏木精-伊红染色显示，小鼠淋巴瘤组织的组织病理学特点与人眼眶DLBCL标本一致。BALB／c小鼠CD20表达强度〈50％和≥50％的淋巴瘤模型中表达例数分别为3和5，CD79α分别为2和6，CD45RO分别为8和0；nod—SCID小鼠CD20表达强度〈50％和≥50％的淋巴瘤模型中表达例数分别为1和3，CD79μ分别0和4，CD45RO分别为4和0；与人眼眶DLBCL标本的1和2，1和2，2和1比较，差异均无统计学意义（均P=1．00）；BALB／c和nod—SCID小鼠淋巴瘤模型与人眼眶DLBCL中Ki-67和survivin表达的例数差异均无统计学意义（均P=1．00）。BALB／c小鼠、nod—SCID小鼠淋巴瘤模型和人眼眶DLBCL中依据CD10、BCL-6和mum-1的表达均分为非生发中心来源型。结论采用pfeiffer细胞系接种法可成功建立眼眶和皮下DLBCL的小鼠模型，这些模型肿瘤在生物学行为、病理学特点和免疫组织化学染色方面均一致。Nod—SCID小鼠较BALB／c小鼠接种后肿瘤生长更快。

Anti-μ诱导人类B淋巴细胞株MBC-1凋亡的研究

目的：研究抗人ＩｇＭ（ａｎｔｉμ）在体外对表面ＩｇＭ阳性的人类Ｂ淋巴瘤细胞株ＭＢＣ１细胞及Ｍｏｒａ细胞增殖活性的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：应用细胞形态学、流式细胞仪分析及ＤＮＡ凝胶电泳等。结果：测得ａｎｔｉμ对ＭＢＣ１细胞增殖有抑制作用，并存在剂量和时间相关性，而对Ｍｏｒａ细胞则无此作用；并证实ＭＢＣ１细胞的死亡是通过细胞凋亡引起的，具有凋亡的分子水平和形态学特征。结论：ＭＢＣ１细胞可作为研究人类Ｂ细胞表面抗原受体交联所致凋亡的一个实验模式，并为探讨凋亡在个体发育时免疫耐受形成过程中所起的作用提供了良好的实验依据。

uc.477+在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达研究

目的根据超保守RNA uc.477+在小鼠正常B细胞与小鼠B淋巴瘤细胞中的表达差异,探讨uc.477+对小鼠B淋巴瘤细胞增殖的影响。方法从C57BL/6野生型小鼠脾脏中分选出正常B细胞,RT-PCR检测uc.477+在小鼠正常B细胞与B淋巴瘤细胞中的表达。将uc.477+基因片段构建到pMSCV-PIG逆转录病毒表达载体上,过表达质粒477-pMSCV-PIG和空载体质粒pMSCV-PIG经293T包装成逆转录病毒感染小鼠淋巴瘤细胞38B9,倒置荧光显微镜和流式细胞术检测感染率。细胞计数和细胞周期检测uc.477+过表达后38B9细胞株和空载体38B9细胞株的增殖变化。结果uc.477+在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达显著高于小鼠正常B细胞。稳定过表达uc.477+38B9细胞株和空载体38B9细胞株构建成功。uc.477+过表达38B9细胞株比空载体38B9细胞株增殖能力强。结论超保守RNA uc.477+在小鼠B淋巴瘤细胞中的表达显著高于小鼠正常B细胞中的表达。uc.477+能促进小鼠B淋巴瘤细胞增殖。

掌叶半夏有效提取物对HeLa细胞的作用及机制

目的观察中药掌叶半夏有效提取物(Pinellia extract,PE)对HeLa细胞的作用,并对可能的机制进行初步研究,为其临床用于防治女性宫颈病变提供科学依据。方法用倒置相差显微镜观察细胞生长并摄影,MTT法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原(proliferatingcell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达,免疫荧光实验检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白表达。结果PE对HeLa细胞的生长表现出明显的抑制作用,流式细胞术检测结果显示PE作用后HeLa细胞出现凋亡,且随着作用时间延长,凋亡细胞的比例明显增加;免疫细胞化学实验和免疫荧光实验结果表明:PE作用24 h后HeLa细胞PCNA和Bcl-2蛋白表达均明显减少。结论PE对HeLa细胞有明显的抑制生长和促进凋亡的作用,其促凋亡机制是通过降低PCNA和Bcl-2蛋白表达来实现的,这为进一步研究PE的作用机制以及抗癌新药的研制开发奠定了初步的实验基础。

食道通结方对裸鼠食管癌移植瘤中TE-1细胞增殖及凋亡的影响

目的通过体内实验观察食道通结方对食管癌细胞株TE-1细胞增殖和凋亡的影响,以进一步明确该方治疗食管癌的作用机制。方法裸鼠皮下接种食管癌TE-1瘤株,将荷瘤裸鼠随机分成模型组、中药组、顺铂组、中药+顺铂组,每组10只,其中中药选取食道通结方。各组均灌胃2周后,处死裸鼠,分离瘤块。称取瘤重,计算肿瘤抑制率;HE染色观察TE-1细胞形态的变化、细胞凋亡的变化;免疫组化检测肿瘤组织内B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase 3)蛋白表达的变化。结果中药组、顺铂组和中药+顺铂组平均瘤重均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01),抑瘤率分别为45.95%、48.65%、56.76%;顺铂组平均瘤重与中药组相比差异无统计学意义(P>0.05),中药+顺铂组平均瘤重低于中药组,差异有统计学意义(P<0.01)。在形态变化上,中药组、顺铂组和中药+顺铂组细胞部分形态呈圆形或卵圆形,细胞核浆比例减小,其中中药+顺铂组变化最为显著;免疫组化结果显示,中药组、顺铂组和中药+顺铂组Bcl-2 OD值明显低于模型组,其中以中药+顺铂组最低,差异有统计学意义(P<0.01);中药组与顺铂组比较,差异无统计学意义(P>0.05),中药组Bcl-2 OD值高于中药+顺铂组,差异有统计学意义(P<0.01)。中药组、顺铂组和中药+顺铂组caspase 3的OD值明显高于模型组,其中以中药+顺铂组最高,差异有统计学意义(P<0.01);中药组与顺铂组相比差异无统计学意义(P>0.05),中药组caspase 3的OD值低于中药+顺铂组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论食道通结方具有抑制食管癌细胞株TE-1增殖、促进其凋亡的作用,该作用可能与下调食管癌细胞株TE-1中Bcl-2的表达,上调caspase3的表达相关。

人淋巴瘤细胞株OCI-Ly19生物学特性研究和小鼠模型建立

目的弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人淋巴瘤中最常见的病理类型。DLBCL分型对指导疾病的治疗和预后有较大的意义,但各型DLBCL的发病机制及治疗、预后尚还有待深入研究。文中探索DLBCL细胞株OCI-Ly19的体外培养条件和生物学特性,肿瘤相关分子的表达及DLBCL动物模型的建立方法。方法观察OCI-Ly19细胞生长形态及生物学特性,分析比较不同实验条件对细胞生长的影响,用流式细胞术分析相关抗原表达,将OCI-Ly19细胞皮下接种SCID小鼠,观察肿瘤生长状况及组织学形态。结果 OCI-Ly19细胞在适当培养条件下生长良好,多数重要的B细胞和肿瘤相关标记物均有不同程度的表达;未经照射的SCID小鼠皮下接种107个OCI-Ly19细胞,成瘤率75%,组织学特征符合人类DLBCL的特点。结论获得了OCI-Ly19细胞株体外培养的最佳条件及相关免疫标志物表达情况。成功构建了人DLBCL的小鼠模型,为进一步进行相关研究提供了实验基础。

依鲁替尼对伯基特淋巴瘤细胞生长抑制及诱导凋亡的作用及机制研究

目的:研究依鲁替尼(ibrutinib)在体外对伯基特淋巴瘤细胞株Namawal的作用,探讨其可能的分子机制。方法:应用CCK8法,细胞周期分析法检测依鲁替尼作用于Namawal细胞株后,对其增殖、细胞周期等细胞生物学的影响;应用免疫荧光电镜观察药物作用该细胞株后48H细胞核变化;应用免疫印迹法检测ibrutinib作用于Namawal后BTK信号通路相关蛋白的变化。结果:经依鲁替尼处理后的Namawal细胞增殖受到明显抑制;依鲁替尼下调BTK信号通路上相关蛋白活性。结论:依鲁替尼通过抑制p-BTK活性抑制细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,是治疗Burkitt淋巴瘤的潜在新药。

伊布替尼治疗伴MyD88突变难治性弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后的临床分析

目的探讨伊布替尼对伴髓样分化因子(MyD)88突变难治性弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的疗效及预后。方法选择2018年8月至2020年8月南方医科大学珠江医院肿瘤科收治的134例难治性DLBCL患者为研究对象,按照随机数表法将患者按2∶1分为训练集(n=94)和测试集(n=40)。其中,训练集患者年龄为60~78岁,男、女性患者分别为41、53例,根据MyD88基因型将训练集患者分为MyD88突变型组(n=33)和MyD88野生型组(n=61)。测试集患者年龄为62~80岁,男、女性患者分别为18、22例。收集患者的临床病例资料,如性别、年龄、病变部位、DLBCL结外累及部位、Hans分型、Ann-Arbor分期、东部肿瘤协作组(ECOG)评分、血清乳酸脱氢酶(LDH)水平、β2-微球蛋白(MG)水平、CD5表达情况、Ki-67指数、治疗方案、既往治疗方案种类、MyD88突变等。采用χ^(2)检验比较2组患者的临床资料、伊布替尼疗效等定性资料;采用Kaplan-Meier法绘制不同患者生存曲线,采用log-rank检验进行不同患者生存曲线比较。采用Cox比例风险回归模型进行难治性DLBCL患者预后影响因素的单因素及多因素分析,建立列线图模型,并采用受试者工作特征(ROC)曲线,校准曲线,临床决策曲线分别对模型的区分度、准确性和有效性进行评价,同时建立预测患者预后的危险分层系统。2组患者性别构成比、年龄等一般资料分别比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究经南方医科大学珠江医院伦理委员会审核批准(批准文号:32846),所有患者均签署临床研究知情同意书。结果①MyD88突变型组难治性DLBCL患者采取伊布替尼治疗后的客观缓解率(ORR)和疾病控制率(DCR)分别为60.6%(20/33)和97.0%(32/33),均高于MyD88野生型组的34.4%(21/61)和82.0%(50/61),并且差异有统计学意义(χ^(2)=5.97,P=0.015;χ^(2)=4.33,P=0.037)。训练集94例难治性DLBCL中MyD88野生型组患者的2年无进展生存(PFS)率和总体生存(OS)率分别为64.8%和63.7%,MyD88突变型组分别为63.6%和62.3%,2组患者中位PFS期分别为16.0和11.7个月,中位OS期分别为18.1和13.2个月,2组分别比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。②采用伊布替尼联合其他药物治疗的患者中,MyD88野生型者(n=25)的2年PFS和OS率分别为57.5%和54.7%,均高于MyD88突变型者(n=21)的50.3%和48.2%,并且差异均有统计学意义(χ^(2)=9.37、P=0.002,χ^(2)=7.79、P=0.005)。③对难治性DLBCL患者PFS、OS率进行多因素Cox比例风险回归模型分析结果显示,ECOG评分≥2分(HR=1.846,95%CI:1.476~2.283,P=0.036),LDH水平≥250 IU/L(HR=2.983,95%CI:2.525~3.358,P=0.008),β2-MG表达呈阳性(HR=3.241,95%CI:2.508~3.956,P=0.005),既往治疗方案种类>2种(HR=3.062,95%CI:2.547~3.618,P=0.011),伴MyD88突变(HR=3.742,95%CI:3.028~4.439,P=0.041)是难治性DLBCL患者PFS率的独立危险因素。ECOG评分≥2分(HR=3.726,95%CI:1.842~3.677,P=0.014),β2-MG表达呈阳性(HR=2.529,95%CI:1.927~3.124,P=0.027),既往治疗方案种类>2种(HR=2.796,95%CI:2.145~3.425,P=0.018),伴MyD88突变(HR=2.483,95%CI:2.139~2.917,P=0.024)是难治性DLBCL患者OS率的独立危险因素。④构建预测患者PFS和OS率的列线图模型,训练集和测试集的ROC曲线下面积分别为0.856(95%CI:0.801~0.924)和0.849(95%CI:0.795~0.918),灵敏度分别为90.28%和88.46%,特异度分别为87.42%和85.93%,对患者预后情况区分度较好。预测患者PFS和OS率的列线图模型的校准曲线评价结果显示,训练集、测试集的预测值和实际观测值拟合度良好(χ^(2)=1.21、P=0.093,χ^(2)=1.31、P=0.085),一致性、准确性均较好。预测患者PFS和OS率的列线图模型的临床决策曲线评价结果显示,训练集和测试集在高风险阈值为0~0.9时,净获益值均为正值,即具有明显的正向净收益,具有良好的临床实用性。⑤根据对难治性CLBCL患者危险评分总分,将40例测试集患者分为3个危险组:低风险组(n=12,总分<65分),中风险组(n=16,5分≤总分<105分),高风险组(n=12,总分≥105分),其中低、中、高风险组难治性DLBCL患者比例分别为30%(12/40),40%(16/40)和30%(12/40)。3组患者的OS率比较,差异有统计学意义(Z=6.15,P=0.010),提示该危险分层系统能较好区分患者生存情况。结论MyD88突变与难治性DLBCL患者的临床特征及伊布替尼疗效有关,采用伊布替尼联合其他药物治疗可改善伴MyD88突变患者的预后。预测患者DFS和OS率的列线图模型对预测难治性DLBCL患者预后的区分度较高,准确性和有效性较好。