大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达及初步纯化

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂活性。从大肠杆菌中调出LTB的原始基因,将该基因克隆、构建pET21b-LTB表达载体、转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并对表达产物进行初步纯化;经DNA测序、SDS-PAGE、ELISA检测,结果表明成功构建了能够稳定表达可溶性LTB的菌株,并获得初步纯化LTB的方法。为今后LTB的研究及应用奠定了基础。

大肠杆菌脂蛋白与CTB-pres2抗原基因的融合及表达

首次采用基因融合方式，在乱毒素B亚基-乙型肝炎病毒Pres2抗原融合基因（ctxB-Pres2）的5’端了引入编码大肠杆菌脂蛋白信号肽及N端九个氨基酸的核苷酸序列，分别置于ctb及lpp／lac启动子下在大肠杆菌中获得分泌性表达．表达的融合蛋白均定位于膜上，并且可以和GM1、抗-CTB抗体及抗HBVPreS2单克隆抗体结合，说明该融合蛋白保留了CTB的基本高级结构及CTB、PreS2抗原的抗原性．3H-棕榈酸标记实验证实该融合蛋白发生脂肪化，为免疫原性研究奠定了基础．此外，还研究了不同信号肽和宿主菌对该蛋白表达的影响．

大肠杆菌O157VT2 B亚基基因的克隆与表达

目的对大肠杆菌O157VT2毒素B亚基基因进行克隆、表达与鉴定,为VT2毒素的抗原、抗体大规模制备及疾病的预防、诊断和疫苗研究打下基础。方法设计寡核苷酸引物,利用PCR技术从出血性大肠杆菌O157的染色体基因组中扩增出VT2毒素B亚基基因,连接到表达载体pET-28a以构建重组质粒。将重组质粒转入表达宿主菌BL21感受态细胞,通过IPTG诱导进行表达,对表达蛋白进行SDSPAGE电泳分析和Western检测。结果用PCR方法扩增出了预期大小的VT2B亚基基因,克隆得到重组质粒pET28aVT2B,转化后宿主菌成功表达分子量为8kD的目的蛋白,用特异抗体经Western检测该条带为阳性反应。结论目的基因成功克隆到宿主菌内,目的蛋白得到高效表达,最佳诱导时间为4h,目的蛋白表达量可达总蛋白量45.72%。