人类免疫缺陷病毒-1B和C亚型Nef蛋白特异性CD8^+ T细胞交叉应答反应的研究

目的:探讨中国人群人类免疫缺陷病毒-1B(H IV-1B亚型)Nef蛋白特异性CD8+T细胞应答在B、C亚型间的交叉反应性。方法:选取51例H IV-1B亚型感染者,采取外周血单个核细胞(PBMC),用合成的54个H IV-1B、C亚型Nef全基因序列肽库作为抗原,酶联免疫斑点吸附试验(ELISpot)方法检测H IV-1B亚型Nef蛋白特异性CD8+T细胞对B、C亚型抗原的应答反应。结果:在产生特异性应答效应的个体中,82.9%(29/35)感染个体同时识别B和C亚型肽段。感染个体在对两个亚型肽段的识别数量及应答强度上无显著差异(P=0.529和P=0.754)。H IV-1B亚型特异性CD8+T细胞能针对70.4%无论B还是C亚型的Nef肽段产生应答反应。被特异性CD8+T细胞同时识别的B、C亚型Nef肽段间氨基酸序列的同源性显著高于仅能被识别的B亚型或C亚型肽段的氨基酸序列(P=0.01)。结论:H IV-1B亚型Nef蛋白特异性CD8+T细胞应答在B、C亚型间具有良好的交叉反应性,能产生交叉反应的氨基酸序列具有较高的亚型间同源性。

胃癌患者外周血Serpin B1水平及其基因多态性检测的意义

目的 检测胃癌患者外周血中丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（Serpin B1）基因H67Q位点多态性的情况及Serpin B1蛋白的水平,并对其关系进行探讨。方法 选取2013年1月至2015年12月在本院就诊并确诊为胃癌的350例患者为病例组,同期健康体检者350例为对照组。留取外周血,应用PCR扩增联合DNA直接测序法检测Serpin B1基因H67Q位点在2组中的分布情况,同时检测Serpin B1蛋白的水平。将病例组和对照组按基因型再次分组,观察各基因型与Serpin B1浓度的关系。Logistic回归分析探讨Serpin B1基因H67Q位点多态性与胃癌的关系。结果 Serpin B1基因H67Q位点存在T和G2种等位基因,共发现3种基因型：野生型纯合子（TT）、杂合突变型（GT）、纯合突变型（GG）。病例组GG、GT基因型频率及G等位基因均显著高于对照组（P〈0.05）。病例组外周血Serpin B1浓度水平明显高于对照组（P〈0.05）。按基因型分组后,病例组和对照组中GG基因型者外周血Serpin B1浓度水平明显高于GT、TT基因型者,GT基因型者外周血Serpin B1浓度高于TT基因型（P〈0.05）。Logistic分析结果显示,GG基因型及G等位基因是胃癌的独立危险因素（OR值为9.485,95%CI为2.169~44.283,P=0.006;OR值为5.105,95%CI为1.847~13.360,P=0.014）。结论 Serpin B1基因H67Q位点多态性与胃癌有关。

胃癌组织和转移淋巴结中丝氨酸蛋白酶抑制剂B1表达与肿瘤侵袭转移的关系

目的检测胃癌组织和转移淋巴结中丝氨酸蛋白酶抑制剂B1(Serpin B1)的蛋白质表达情况,探讨Serpin B1与肿瘤侵袭转移的关系。方法采用免疫组织化学方法检测80例胃癌组织、区域淋巴结和癌旁正常胃黏膜石蜡标本中的Serpin B1、周期素D1(cyclin D1)、细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的蛋白质表达情况;采用Western印迹法检测8例胃癌患者的胃癌组织、区域淋巴结和癌旁正常胃黏膜新鲜标本中Serpin B1蛋白质的表达情况。收集患者的临床资料,记录其临床特征,分析胃癌组织中Serpin B1蛋白质表达与临床特征的关系。测定并比较原发肿瘤、阳性转移淋巴结组织、癌旁正常组织中Serpin B1、cyclin D1、ICAM-1、MMP-9蛋白质表达水平。结果浸润深度较深、临床分期较晚、分化程度差、淋巴结转移阳性和有脉管瘤栓的胃癌患者中Serpin B1蛋白质表达阳性患者的比例显著高于浸润深度较浅、临床分期较早、分化程度好、淋巴结转移阴性和无脉管瘤栓的胃癌患者(P值均<0.05)。胃癌组织和转移淋巴结组织中Serpin B1、cyclin D1、ICAM-1、MMP-9蛋白质表达阳性率均显著高于癌旁正常组织(P值均<0.01);转移淋巴结中Serpin B1、MMP-9蛋白质表达阳性率显著高于胃癌组织(P值分别<0.01、0.05),cyclin D1、ICAM-1蛋白质表达阳性率与胃癌组织间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。Western印迹法检测结果显示,转移淋巴结组织中Serpin B1蛋白质水平显著高于胃癌组织(t=2.791,P=0.014)和癌旁正常组织(t=11.828,P<0.001),胃癌组织中Serpin B1蛋白质水平显著高于癌旁正常组织(t=7.247,P<0.001)。Spearman相关分析显示,胃癌组织与转移淋巴结中Serpin B1蛋白质(r=0.465 2)、cyclin D1蛋白质(r=0.352 2)表达呈正相关(P值均<0.01),与ICAM-1蛋白质(r=0.208 6)、MMP-9蛋白质(r=0.145 8)表达不相关(P值均>0.05)。胃癌组织中Serpin B1蛋白质表达与ICAM-1蛋白质(r=0.342 2)、MMP-9蛋白质(r=0.326 8)表达呈正相关(P值均<0.01),与cyclin D1蛋白质表达不相关(r=0.164 6,P=0.144 6);转移淋巴结中Serpin B1蛋白质表达与MMP-9蛋白质表达呈正相关(r=0.305 2,P=0.018 0)。结论胃癌组织中Serpin B1蛋白质的表达存在异常,可能通过调节ICAM-1、MMP-9蛋白质参与胃癌的侵袭转移。

基于线粒体细胞色素b基因的中国大沙鼠系统地理格局

通过内蒙、新疆、甘肃的41个大沙鼠样品和1个伊朗撒拉克大沙鼠的mtDNA Cytb基因全序列的遗传分析,对我国大沙鼠(Rhombomys opimus)的分子系统地理学进行了初步探讨。结果表明,我国41个大沙鼠样品的Cytb基因包含了50个核苷酸变异位点(占全序列的4.39%),其中转换48个,颠换2个,共定义23个单倍型。在四个地理种群中,内蒙古中部半荒漠区和阿拉善荒漠区的单倍型多样性最高,甘新荒漠区的单倍型多样性最低;北疆荒漠区的核苷酸多样性最高,内蒙古中部半荒漠区的核苷酸多样性最低。分子变异分析(AMOVA)表明,种群间的遗传变异占51.68%,种群内的遗传变异占48.32%。FST统计结果表明,除内蒙古中部半荒漠区与阿拉善荒漠区地理种群之间差异显著外(P<0.05),其它地理种群间的差异均极显著(P<0.01)。基于单倍型的系统树显示,42只大沙鼠形成三支。其中,伊朗撒拉克地区大沙鼠和中国地区大沙鼠之间的亲缘关系比中国两支大沙鼠之间的亲缘关系远;分析表明,中国分布的大沙鼠两支之间分歧时间估计在0.093Ma前。嵌套支分析表明,大沙鼠历史种群曾发生过异域片段化、受阻碍基因流和持续种群扩张事件。种群扩张分析提示大沙鼠在0.0119Ma前曾经历过一次种群扩张事件,种群可能受到末次冰期波动的影响。

HIV-1 C/B’亚型多价重组MVA病毒疫苗免疫原性的研究

目的:检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)C/B’亚型与痘苗病毒安卡拉株(MVA)的多价重组疫苗的免疫原性,此疫苗中包含HIV-1C/B’CRF株的5个基因,分别是env,gag,pol,nef,tat。方法:设105pfu/ml,106pfu/ml,107pfu/mlADMVA3个剂量组,用ELISPOT方法检测细胞免疫反应。同时,以Gag蛋白作为包被抗原,使用间接ELISA的方法检测体液免疫反应。结果:免疫后的小鼠对插入基因env,gag,pol和nef所表达蛋白均产生了特异性细胞免疫应答,且免疫效果与免疫剂量呈正相关。ELISA结果表明,MVA重组疫苗免疫诱导产生了特异性体液免疫,抗HIV-1Gag的抗体滴度与免疫次数和免疫剂量都存在正相关性。结论:多价MVA重组疫苗能有效地诱导小鼠产生特异的细胞免疫和体液免疫反应。

HIV-1复制型DNA疫苗与非复制型重组痘苗病毒疫苗在小鼠体内细胞免疫效果的研究

目的:用HIV-1复制型DNA疫苗和非复制型重组痘苗病毒疫苗(rNTV-C)进行单独免疫和联合免疫的研究(2种疫苗分别包含HIV-1 B'/C亚型的gp160、gag-pol、rev-tat-nef等6种基因),以了解这2种新型HIV疫苗单独免疫及联合免疫的效果,并为临床免疫方案的制定提供实验依据。方法:将HIV-1 DNA疫苗和rNTV-C疫苗免疫BALB/c小鼠,设计rNTV-C单独免疫组、DNA单独免疫组,以及DNA初免、rNTV-C加强的联合免疫组,并设计不同免疫途径和不同剂量的各种组合。用IFN-γELISPOT检测各组的细胞免疫效果,用统计学方法分析比较各组细胞免疫效果的差异。结果:DNA疫苗和rNTV-C疫苗单独免疫时,二者都能诱发针对各抗原的特异性免疫反应;联合免疫能够诱发比DNA或rNTV-C单独免疫都强的特异性细胞免疫反应。统计分析显示,2种疫苗采用肌肉注射途径的免疫效果显著高于皮内注射,1μg和5μg DNA疫苗的免疫效果差异不显著,而1×108 PFU的rNTV-C比2×107PFU的免疫效果要强。结论:联合免疫策略能够显著增强HIV-1疫苗各抗原的免疫原性,通过对2种HIV-1疫苗单独免疫及二者联合免疫的细胞免疫反应的分析比较,确定了较好的免疫方案,为疫苗临床前免疫效果评价和临床方案的制定提供了实验依据。

骨化三醇对角质形成细胞作用机制的差异蛋白质组学研究

目的研究骨化三醇对角质形成细胞蛋白质表达的影响,寻找骨化三醇作用的靶蛋白。方法常规培养HaCaT细胞、药物诱导,避光培养48h后用反复冻融法提取细胞全蛋白。将提取的蛋白样品采用固相pH梯度双向凝胶电泳进行分离,应用ImageMaster 2D Platinum 5.0软件对图像进行匹配分析,选取各组中有重叠的药物作用前后浓度改变的10个蛋白质点,经基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行质谱鉴定。结果成功获得HaCaT细胞的蛋白质组电泳图谱,图像重复性好。药物作用后蛋白质表达有明显变化,以抑制为主。共鉴定出四种蛋白质,其中一种为卵清蛋白样丝氨酸蛋白酶抑制剂1(MNE1)。结论成功建立了HaCaT细胞蛋白质二维展示平台。MNE1是骨化三醇的治疗机制中的靶蛋白之一。

HIV-1 B'亚型gag-env融合基因的DNA疫苗构建和免疫原性分析

目的构建HIV-1 B’亚型中国流行株gag和env融合基因的DNA疫苗,对其免疫原性进行研究。方法根据已报道的HIV-1 B’亚型RL42分离株gag和env基因的氨基酸序列按哺乳动物密码子使用频率进行优化并人工合成基因,插入真核表达载体pDRVISV1．0中,构建表达RL42 gag- env融合蛋白的DNA疫苗,pSVRL／GE。用Western blot和抗gag p55抗体细胞内染色的方法体外检测pSVRL/GE的表达效率。DNA疫苗pSVRL／GE免疫BALB／c小鼠后,用ELISPOT检测小鼠的细胞免疫反应。结果限制性内切酶鉴定表明融合基因已成功插入pDRVISV1．0载体中,Western blot证实融合基因可有效表达融合蛋白;细胞内染色结果表明,pSVRL/GE转染的293T细胞中49．8％表达gag p55,荧光强度均值为924;而空载体pDRVISV1．0转染的293T细胞中非特异背景染色只有0．5％。经免疫的小鼠脾细胞体外用H-2d限制性表位肽AMQMLKET刺激后,ELISPOT检测显示,pSVRL/GE免疫小鼠每106脾细胞形成226个斑点(SD=140),而空载对照组每106脾细胞形成29个斑点(SD=16)(P< 0．05)。结论所构建的DNA疫苗pSVRL/GE可高效表达相应抗原蛋白,并可有效激活机体的细胞免疫反应。

不同疾病进展阶段的HIV-1 B亚型毒株感染者对Gag、Nef肽段库的特异性CTL应答比例的比较和分析

目的对不同疾病进展阶段的HIV-1B亚型毒株感染者Gag、Nef特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)应答进行研究,比较和分析不同患者群对不同肽段库应答比例的异同,探讨针对不同肽段库的特异性CTL应答在延缓病程进展中所起的作用。方法选取56例未经抗病毒治疗的中国HIV-1B亚型毒株感染者。其中包括长期无进展者(long-term nonprogressors,LTNP)、HIV感染早中期患者和AIDS患者3组不同疾病进展阶段患者。以覆盖HIV-1 Gag全长和部分Nef的14个肽段库为刺激原,应用IFN-γELIDSPOT法测定3组患者的特异性CTL应答,并比较3组患者对不同肽段库的应答比例。结果3组不同进展阶段患者对14个肽段库总体的特异性CTL应答的平均反应宽度和强度间差异均无统计学意义。3组患者对14个肽段库的识别模式可分为两种类型：(1)对Gag-p24-1、Gag-p24-5、Gag-p2/7/1/6-1以及Gag-p2/7/1/6-3这4个肽段库的识别比例高低与病情进展情况相平行。3组患者对4个肽段库整体的识别比例间差异有统计学意义(P=0．041)；(2)对其他10个肽段库的识别与病情进展不平行,在HIV感染早中期患者中比例高,而在LTNP中低。结论针对不同肽段库的CTL应答可能在控制病毒复制过程中发挥不同的作用,对疾病进展的控制可能需要针对多个抗原表位的有效CTL应答。