解淀粉芽孢杆菌B1619脂肽类抗生素的分离鉴定及其对番茄枯萎病菌的抑制作用

【目的】从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)生防菌株B1619发酵液上清中分离脂肽类抗生素,分析其抑菌活性相关成分,为应用解淀粉芽孢杆菌B1619菌株防控番茄枯萎病提供依据。【方法】利用特异性引物对B1619中3种脂肽类抗生素合成相关基因sfp、ituA和fenB进行检测;通过盐酸沉淀、甲醇抽提法等方法提取脂肽类抗生素粗提物;用Supelclean^(TM) LC^(-1)8柱及PHASE HF-NH2柱对3种脂肽类抗生素粗提物进行分离;通过MALDI-TOF-MS和HPLC分析、鉴定3种脂肽类抗生素;采用平板对峙培养分别测定3种脂肽类抗生素粗提物对番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的抑菌活性。【结果】从解淀粉芽孢杆菌B1619的基因组DNA中扩增sfp、ituA和fenB等脂肽类抗生素合成基因,扩增产物经克隆、测序分析,表明B1619菌株中含有这3个基因。通过HPLC分析,发现60%甲醇洗脱液分离物分别在12、16.5、18 min处出现相应峰值,保留时间与bacillomycin L标准品一致,分泌量为18.5 mg·L^(-1);70%甲醇洗脱液分离物分别在22、34、37、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与fengycins标准品一致,分泌量为5.1 mg·L^(-1);100%甲醇洗脱液分离物分别在27、37、41、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与surfactins标准品一致,分泌量为74.3 mg·L^(-1)。经液质联用进一步验证分析3种脂肽类抗生素的质子化峰值,60%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 043.4、1 057.5和1 071.4 Da,是C13—C15的bacillomycin L;70%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 463.9、1 477.9、1 491.9和1 505.9Da,是C15—C17的fengycins;100%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 008.6、1 022.7和1 036.7 Da,是C13—C15的surfactins。平板对峙法试验结果表明1 mg·m L^(-1) bacillomycin L和fengycins对番茄枯萎病菌有较强的抑菌效果,而1 mg·m L^(-1)surfactins对番茄枯萎病菌的抑菌活性较弱,再将surfactins的浓度提高至3和6 mg·m L^(-1),发现其抑菌效果没有明显变化。【结论】B1619菌株分泌3种脂肽类抗生素,其中对番茄枯萎病菌生长起重要抑制作用的抗生素是bacillomycin L和fengycins,surfactins对番茄枯萎病菌的抑制活性较弱。

解淀粉芽孢杆菌B1619对番茄的促生作用

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens B1619是一株对设施番茄土传病害具有很好防治效果的生防菌株。为了明确其对番茄的促生作用,本研究通过室内盆栽试验研究了不同稀释倍数的生防菌B1619发酵上清液对番茄种子萌发和幼苗生长的影响;测定了喷施B1619菌液后番茄体内叶绿素、胡萝卜素和根系活力的变化;运用液质联用法检测了生防菌B1619上清液中促生相关物质（生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和亚精胺）的含量。结果表明,生防菌B1619不同浓度的上清稀释液对番茄种子萌发和幼苗生长均有一定的促进作用,其中以100倍稀释液（4.8×10~7 cfu/mL）促生作用最大;用生防菌B1619不同浓度的上清稀释液对番茄喷施后,番茄植株的叶绿体色素、胡萝卜素和根系活力均有不同程度的增加,其中以100倍稀释液各生理指标活性增加最大（分别增加47.92%、38.37%和49.75%）;生防菌B1619上清液中生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）和亚精胺（Spd）的含量分别为1.90、1.30、0.0544、1.94和1.22 mg/L。本研究结果证实了解淀粉芽孢杆菌生防菌株B1619对番茄生长具有显著促生作用,且促生物质主要存在于上清液中。

解淀粉芽孢杆菌B1619对加工番茄幼苗促生及培育壮苗的影响

【目的】研究解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens B1619对加工番茄幼苗促生和苗期病害防控的综合作用,为培育壮苗,提供绿色的管理技术。【方法】采用室内穴盘育苗试验,分别用基质拌药和苗期喷雾法,研究解淀粉芽孢杆菌B1619对加工番茄幼苗生长的促进作用,以及对苗期病害的预防作用,研究其促生和防病的效果。【结果】各处理的出苗率达到稳定状态,呈现出现先抑制后促进的生长态势。1∶150出苗率最好、1∶100次之,1∶200出苗率较差,拌土法比喷雾法对番茄株高的促生作用更强。以1∶150拌土对番茄茎粗的促进作用最强。不同拌土量处理的叶绿素含量与对照之间具有极显著性差异,叶绿素含量比对照增加7.68%~10.20%,拌土法对幼苗猝倒病具有较强的预防作用,1∶150和1∶200拌土发病率只有0.00~0.08%。【结论】解淀粉芽孢杆菌B1619能够改善加工番茄育苗穴盘的土壤生态环境,施用后土壤蓬松,对番茄根系和幼苗的生物量比对照有显著性增加;叶片颜色较深,叶绿素含量增加。能够提高番茄免疫力,增强抗病性,对加工番茄幼苗猝倒病具有较强的预防作用。

江苏省3个番茄种植基地枯萎病菌种群数量监测及生防菌B1619的控病效果

为明确生防细菌B1619对番茄枯萎病的田间防治效果,分离鉴定了江苏省铜山、溱潼和沭阳3个番茄种植基地枯萎病菌的种类,检测了番茄全生育期土壤中枯萎病菌的种群数量变化。结果表明,分离获得的枯萎病菌分别属于镰刀菌属的3个种,它们出现的平均频率分别为:尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum为74.5%;茄病镰刀菌F.solani为21.3;轮枝镰刀菌F.verticillioides为4.2%。尖孢镰刀菌是引起番茄枯萎病的优势种群。3个番茄种植基地番茄全生育期枯萎病菌种群数量消长规律基本一致,番茄枯萎病菌数量在番茄定殖后迅速繁殖,盛果期达到最大值,采收后数量开始下降。在番茄定植时用生防菌B1619处理土壤后,枯萎病菌的数量明显比未处理过的对照低,在盛果期枯萎病菌的种群数量平均下降了43%,说明生防菌B1619对番茄枯萎病菌的生长繁殖具有较好的抑制作用。在3个番茄种植基地开展了生防菌B1619防控番茄枯萎病田间试验示范,结果显示,用生防菌B1619处理土壤后,铜山基地的番茄枯萎病发病率为1.5%(对照17.8%);溱潼基地没有发病;沭阳基地的发病率为0.1%(对照52.3%)。生防菌B1619具有开发成防治设施茄科蔬菜枯萎病生物杀菌剂的潜力。

正交法优化解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂加工工艺

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens生防菌株B1619对设施蔬菜土传病害有较好的防治效果。为了最大限度降低加工工艺对生物杀菌剂B1619水分散粒剂中含菌量的影响,作者通过单因子水平筛选和正交试验,对B1619水分散粒剂主要助剂配比和颗粒制备条件进行了优化。结果表明:3种主要助剂的最佳配比(质量分数)组合为:硅酸镁铝1.0%、萘磺酸盐甲醛3.0%、硫酸铵4.5%,优化后颗粒含菌量比初始含菌量提高了152.0%;最佳颗粒制备条件为:筛孔粒径1.5 mm、烘干温度65℃、烘干时间20 min,优化后颗粒含菌量比初始含菌量提高了160.0%。验证试验表明,加工工艺优化前B1619水分散粒剂颗粒的含菌量为2.50×108 cfu/g,优化后颗粒的含菌量为1.05×109 cfu/g,优化率为320.0%,优化效果十分显著。

解淀粉芽孢杆菌B1619对设施蔬菜根结线虫病的防治效果

通过设施大棚药效试验,探究解淀粉芽孢杆菌B1619对设施蔬菜根结线虫病的防治效果;通过室内毒力试验,测定解淀粉芽孢杆菌B1619对蔬菜根结线虫的毒杀效果。设施大棚药效试验结果表明,一般情况下,沟施的田间防效高于穴施;当施用菌粉量较少时,穴施田间防效高于沟施;设施番茄、黄瓜沟施解淀粉芽孢杆菌B1619量为16 g/株时,其防效分别为69.12%、87.77%。室内毒力测定试验结果表明,40%甲基异柳磷乳油对2龄线虫的EC_(50)(24 h)为85.252 1 mg/L,EC_(50)(48 h)为77.704 7 mg/L;解淀粉芽孢杆菌B1619发酵液对2龄线虫的EC_(50)(24 h)为12.056 0 CFU/m L,EC_(50)(48 h)为12.906 6 CFU/m L;解淀粉芽孢杆菌B1619粗提物对2龄线虫的EC_(50)(24h)为稀释9.324 6倍,EC_(50)(48 h)为稀释9.960 4倍。室内外试验结果均表明,解淀粉芽孢杆菌B1619对设施蔬菜根结线虫病有明显的防治效果。

解淀粉芽胞杆菌B1619生物摇瓶发酵工艺的正交优化

解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens B1619对设施蔬菜土传病害有较好的防治效果。为了提高菌株B1619生物发酵效率,本文通过单因子水平筛选和正交试验,对菌株B1619发酵培养基和培养条件进行了优化。结果表明,发酵培养基3个主要因子的最佳配比组合为酵母膏0.25%,大豆粉2.00%,生长素0.05%,优化后生物发酵效率比初始培养基提高了21.79%;发酵培养条件3个主要因子的最佳组合为温度28℃、转速180 r/min、装液量60 mL/250 mL,优化后生物发酵效率比初始培养条件提高了35.42%。经验证,优化后的生物发酵工艺获得的发酵菌液含菌量为7.13×109cfu/mL,与初始发酵工艺的发酵菌液含菌量(3.80×109 cfu/mL)相比,提高了87.83%,优化效率十分显著。

防治设施蔬菜土传病害生防菌株B1619生物学特性的研究

【目的】生防菌株B1619是一株能够防控设施蔬菜土传病害的生防菌株。本文从分泌代谢物种类、生物膜形态、最佳碳源、氮源、无机盐、微量元素、p H和温度方面研究生防菌株B1619的生物学特性。【方法】最佳碳氮源、无机盐、微量元素、p H和温度的研究稀释平板法进行;生物膜通过Msgg培养基培养。【结果】生防菌株B1619可产生蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素蛋白酶培养基、嗜铁素培养基和纤维素酶培养基上产生晕圈,几丁质酶培养基上未产生分解晕圈;可形成致密、厚实的生物膜;最适生长温度为27℃,最适p H为5.9,最佳碳源为甘露醇,最佳氮源为牛肉膏,微量元素丙氨酸、VB1能促进B1619的生长,其中丙氨酸有显著促进作用;无机盐Ca Cl2和Mg SO4促进B1619生长。生防菌株B1619在24 h前处于对数生长期,24 h生长数量最大,24 48 h之后,菌体生长基本达到稳定;24 h主要以菌体形式存在,24 h之后,开始出现芽孢,到72 h达到90%以上的芽孢率。【结论】B1619可以产生蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素,但不分泌几丁质酶;B1619在大多数速效碳源下生长良好,在无机氮源中的生长优于有机氮源;适宜的温度、p H、微量元素和无机盐可以促进B1619的生长;B1619的生长在48 h后基本达到稳定。此外,电镜观察了B1619 24、48、72 h生长过程中的菌体形态变化。

生防菌B1619在番茄根部的定殖及对根际微生态的影响

采用植物MS平板定殖研究法、盆栽试验和土壤酶活性检测技术研究了生防菌B1619在番茄根部的定殖规律,并评估了B1619对番茄根围土壤微生物和酶活性的影响。结果显示,生防菌株B1619在番茄根部定殖能力较强,在MS平板中,定殖量可达108CFU/g根以上。在盆栽试验中,常规土壤中或在接种青枯菌后,番茄根部生防菌的数量都呈现先下降后上升趋势,最后趋于稳定;在第15天时,定殖量达到106CFU/g根。番茄定植后,B1619对根围土壤中真菌和放线菌具有促进作用,而对细菌则表现为先促进后抑制作用。此外,B1619能够提高土壤蔗糖酶活性而抑制土壤脲酶的活性,B1619施用后第15天,蔗糖酶活性达226.3 mg/g土,比对照高88 mg/g土;土壤脲酶活性则与对照组截然相反,呈下降趋势。