尿液高迁移率族蛋白B1、胰岛素样生长因子结合蛋白-7在原发性IgA肾病表达及与病情严重程度和预后的关系

目的分析原发性免疫球蛋白A(IgA)肾病病人尿高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、胰岛素样生长因子结合蛋白-7(IGFBP7)表达及其与病情严重程度和预后的关系。方法选取2018年1月至2020年12月在恩施土家族苗族自治州中心医院诊治的原发性IgA肾病病人104例作为研究对象,根据疾病严重程度分为轻度组(33例)、中度组(44例)和重度组(27例)。对病人进行预后随访,分为预后良好组(78例)和预后不良组(26例)。采用Pearson和Spearman法分别分析尿HMGB1、IGFBP7水平以及二者与血肌酐、24 h尿蛋白定量和病情严重程度、预后不良的相关性;采用logistic回归分析重度原发性IgA肾病以及原发性IgA肾病病人预后不良的影响因素;采用受试者操作特征曲线(ROC曲线)分析尿HMGB1、IGFBP7对重度原发性IgA肾病以及原发性IgA肾病病人预后不良的评估价值。结果轻度、中度和重度组血肌酐、24 h尿蛋白定量、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)和白细胞计数(WBC)、尿HMGB1[(6.72±1.02)μg/L、(9.61±2.17)μg/L、(12.51±3.14)μg/L]、IGFBP7[(2.25±0.58)μg/L、(5.32±1.26)μg/L、(15.72±3.65)μg/L]水平依次显著增加。预后不良组尿HMGB1[(14.92±4.45)μg/L比(7.62±1.26)μg/L]、IGFBP7[(18.73±3.57)μg/L比(3.15±1.03)μg/L]水平显著高于预后良好组(P<0.05)。根据相关性分析得知,尿HMGB1、IGFBP7水平呈正相关(P<0.05),二者均与血肌酐、24 h尿蛋白定量、CRP、PCT和WBC、疾病严重程度和预后不良呈正相关(P<0.05)。根据logistic回归分析得知,HMGB1、IGFBP7是影响重度原发性IgA肾病的危险因素(P<0.05),HMGB1、IGFBP7也是原发性IgA肾病病人预后不良的危险因素(P<0.05)。根据ROC曲线得知,尿HMGB1、IGFBP7二者联合优于各自单独诊断重度原发性IgA肾病(Z_(联合比HMGB1)=2.41、Z_(联合比IGFBP7)=2.32,均P<0.05)。尿HMGB1、IGFBP7二者联合优于各自单独预测原发性IgA肾病病人预后不良(Z_(联合比HMGB1)=2.33、Z_(联合比IGFBP7)=2.12,均P<0.05)。结论原发性IgA肾病病人尿HMGB1、IGFBP7表达水平显著升高,二者与病情严重程度和预后密切相关,二者联合可以更好地评估病人病情严重程度和预后。

B7-1(CD80)基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人Ｂ淋巴瘤细胞系Ｒａｊｉ中克隆到Ｂ７－１（ＣＤ８０）ｃＤＮＡ，并经测序证实。将其插入至真核表达载体ｐＬＸＳＮ中，用脂质体转染小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，Ｇ４１８筛选，并经流式细胞仪检测，得到了细胞表面表达Ｂ７－１的重组克隆。ＰＣＲ从其基因组ＤＮＡ中扩增到Ｂ７－１基因，提示Ｂ７－１ｃＤＮＡ已整合至宿主细胞的基因组ＤＮＡ中。本文为研究Ｂ７－１在肿瘤免疫中所起的作用奠定了基础。

协同激活分子CD80(B7-1)在诱导人T细胞活化中的作用

现已证实ＣＤ８０（Ｂ７－１）是参与Ｔ细胞活化的重要分子。应用ＣＤ８０基因转染的人乳腺癌细胞观察了对Ｔ细胞增殖的影响，结果表明ＣＤ８０分子在抗ＣＤ３模拟的第一信号下能协同刺激Ｔ细胞活化，ＰＭＡ、Ａ２３１８７能明显增强ＣＤ８０的协同作用，且可促进ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ等细胞因子的产生。在第二信号的强度固定后，观察了第一信号的强弱对Ｔ细胞活化的影响，结果显示抗ＣＤ３单抗在１００ｎｇ／ｍｌ时刺激Ｔ细胞增殖最强，浓度高时反而下降。

人共刺激分子B7-1/CD80胞外编码区cDNA的克隆及序列分析

用RT PCR法从人外周血单核细胞克隆了编码共刺激分子B7 1 /CD80胞外区的cDNA ,并用Sanger链终止法进行测序 .结果表明 ,所获cDNA片段的序列与GenBank中已报道的人B7 1 /CD80cDNA序列的对应部分仅有两个碱基存在差异( 6 58位A→T ,773位A→G) ,这为探讨B7 1

基于B7-1/2/CD28/CTLA-4通路探讨扶正祛毒汤干预急性髓系白血病完全缓解患者CD34~+细胞诱导成树突细胞激发T细胞的影响

目的探讨扶正祛毒汤治疗急性髓系白血病完全缓解的可能作用机制。方法12只新西兰大白兔随机分为正常组以及扶正祛毒汤低、中、高剂量组,每组3只。扶正祛毒汤低、中、高剂量组兔分别给予扶正祛毒汤浓缩煎剂5、10、20g/(kg·d)灌胃3d,正常组兔给予等体积蒸馏水灌胃,末次灌胃后心脏取血获得正常血清和扶正祛毒汤低、中、高剂量血清。将急性髓系白血病完全缓解患者骨髓稀释后分离提纯CD34~+细胞,将扩增后的CD34^(+)细胞分为空白组、细胞因子组、正常血清组和扶正祛毒汤低、中、高剂量血清组。除空白组外,其余各组均添加细胞因子诱导9d成为树突细胞。流式细胞术(FCM)检测各组树突细胞表面抗原分子CD83、CD1a、HLA-DR的表达,以及共刺激分子B7-1、B7-2的表达。诱导成熟后的树突细胞分别激发自体和异体T细胞,免疫印迹试验(WB)和RT-qPCR法检测T细胞中特异性表面糖蛋白CD28(CD28)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)蛋白和mRNA的表达。MTT比色法检测激发后的T细胞在不同效靶比时对人髓系白血病细胞株K562的杀伤作用。结果与空白组相比较,细胞因子组、正常血清组和扶正祛毒汤低、中、高剂量血清组树突细胞表面抗原分子CD83、CD1a、HLA-DR的表达明显升高(P<0.05),共刺激分子B7-1、B7-2的表达明显升高(P<0.05);与细胞因子组和正常血清组相比较,扶正祛毒汤低、中、高剂量血清组树突细胞表面抗原分子CD83、CD1a、HLA-DR的表达明显升高(P<0.05),共刺激分子B7-1、B7-2的表达明显升高(P<0.05)。与空白组、细胞因子组和正常血清组相比较,扶正祛毒汤低、中、高剂量血清组CD28蛋白及mRNA表达均明显增加(P<0.05),CTLA-4蛋白及mRNA表达均明显降低(P<0.05),T细胞对K562细胞的杀伤率明显增加(P<0.05),且杀伤作用随效靶比的增加而增强,但正常人T细胞与患者T细胞对K562细胞的杀伤作用无明显差异(P>0.05)。结论扶正祛毒汤治疗急性髓系白血病完全缓解的机制可能与该方能够有效促进急性髓系白血病完全缓解患者骨髓CD34^(+)细胞源树突细胞的成熟,从而抑制共刺激分子B7-1、B7-2与CTLA-4结合,且促进B7-1、B7-2与CD28结合,调控B7-1/2/CD28/CTLA-4信号通路有关。

小鼠抗人B7-1(CD80)单克隆抗体的制备及其对肿瘤细胞的抑制作用

目的制备小鼠抗人B7-1(CD80)单克隆抗体(mAb),研究其对天然表达B7-1的恶性肿瘤细胞体外生长和迁移的影响。方法以人B7-1基因转染的L929-B7-1细胞免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备mAb,并通过流式细胞术检测mAb对肿瘤细胞膜型B7-1的识别。以天然表达B7-1的Daudi细胞、Raji细胞及8266细胞为观察对象,分别加入(5、10、20、40)μg/m L B7-1 mAb处理,采用噻唑蓝(MTT)法检测mAb对肿瘤细胞体外增殖的影响,TranswellTM法分析mAb对肿瘤细胞体外迁移的影响,流式细胞术分析mAb对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。结果成功制备1株能稳定分泌小鼠抗人B7-1 mAb的杂交瘤,命名为5G10。经流式细胞术分析,该抗体与Daudi、Raji、8266、U266、BEL-7402及MCF-7肿瘤细胞的阳性结合率分别为(96.30±2.12)%、(95.70±1.79)%、(96.80±2.48)%、(23.20±2.35)%、(1.68±0.35)%、(0.55±0.04)%;与对照组相比,20μg/m L 5G10 mAb明显抑制Daudi细胞、Raji细胞及8266细胞的增殖,肿瘤细胞迁移率明显降低,细胞凋亡率明显增加。结论小鼠抗人B7-1 mAb能特异性识别和结合不同肿瘤细胞膜表面的B7-1,并能显著抑制天然表达B7-1的肿瘤细胞的体外生长、迁移并促进其凋亡。

从CD28/B7-1探讨雷公藤多甙治疗多发性肌炎的机制

目的通过CD28/B7-1激活T细胞这一途径探讨雷公藤多甙治疗多发性肌炎的分子免疫学机制。方法应用免疫荧光流式细胞计检测PM患者外周血CD4+和CD8+T细胞上CD28/B7-1分子蛋白的表达;RT-PCR法检测CD28/B7-1mRNA的表达。结果PM患者外周血CD4+和CD8+T细胞明显升高,且以CD8+T为主,分子蛋白及mRNA表达增加;经TWP干预后,CD4+和CD8+T细胞数减少CD28/B7-1,CD28/B7-1表达受抑制。结论PM表现为以CD8+T细胞介导的细胞毒作用为主的细胞免疫反应异常,CD28/B7-1与PM的发病密切相关。TWP可能通过抑制CD28/B7-1的表达发挥其治疗效应。

PD-1抑制剂联合来那度胺治疗复发CD5^(+)弥漫大B细胞淋巴瘤临床分析

目的:探讨复发CD5^(+)弥漫大B细胞淋巴瘤的临床特征及治疗方法。方法:收集1例CD5^(+)弥漫大B细胞淋巴瘤患者的资料,分析其临床特征、治疗转归。结果:患者合并噬血细胞综合征,经6周期R-ECHOP方案化疗达完全缓解后复发,给予PD-1抑制剂联合来那度胺治疗2周期再次达完全缓解,伴随着白介素-10表达水平下降。患者前后共化疗15个周期,病情持续处于完全缓解状态,缓解时间达24个月,白介素-10的水平持续处于正常范围。结论:PD-1抑制剂联合来那度胺方案有望成为治疗复发CD5^(+)弥漫大B细胞淋巴瘤新方案。

B7-H1阻断对CD3AK细胞体外生物学活性的影响

目的:探讨B7-H1阻断对CD3AK细胞增殖活化及其抗肿瘤免疫效应的影响。方法:利用CD3单克隆抗体(mAb)刺激健康人外周血淋巴细胞诱导产生CD3AK细胞,然后利用B7-H1阻断型抗体阻断B7-H1通路,3H-TdR渗入法检测阻断后CD3AK细胞的增殖能力,ELISA法检测阻断后CD3AK细胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平,同时将CD3AK细胞作用于膀胱肿瘤BIU-87细胞,MTT法检测阻断后CD3AK细胞的杀伤活性。结果:B7-H1阻断后,CD3AK细胞的增殖能力明显增强,体外存活时间明显延长;其分泌IFN-γ、TNF-α的水平明显提高,而分泌IL-10的水平明显下降;同时CD3AK细胞对BIU-87细胞的杀伤活性亦明显升高。结论:阻断B7-H1通路可以促进和维持CD3AK细胞的增殖和活化,并增强其抗肿瘤的免疫效应。阻断B7-H1通路将有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。

B7-1与CD40L在淋巴瘤免疫治疗中的协同作用

为了研究B7-1与CD40L共刺激途径在淋巴瘤的免疫治疗中的作用,探讨治疗淋巴瘤疫苗有效的作用方式,将A20淋巴瘤细胞株接种在BALB/c小鼠身上以构建荷瘤小鼠模型,将B7-1与CD40L表达载体单独或联合导入肿瘤内,以PBS和空载体作为对照,观察肿瘤生长的情况;应用肿瘤病理切片和HE染色技术观察肿瘤组织形态及淋巴细胞浸润情况,采用CCK-8试剂盒检测荷瘤小鼠脾CTL杀伤效应。结果显示,瘤内注射B7-1或CD40L表达载体可导致肿瘤生长延缓或体积缩小,两者联合注射较对照组和单独注射组的肿瘤消退效应明显增强。肿瘤形态学观察表明,治疗小鼠肿瘤局部有炎性细胞浸润并伴有大面积的坏死,肿瘤局限化;CCK8试剂盒检测显示小鼠脾CTL杀伤能力增强。结论:B7-1与CD40L疫苗对淋巴瘤具有治疗效应,两者联合治疗的效果优于单一治疗。质粒载体瘤内注射可作为一种安全有效的肿瘤疫苗作用方式。

过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞共刺激分子B7-1、B7-2与CD28的表达及意义

目的探讨免疫共刺激分子B7-1、B7-2和CD28在过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其意义。方法应用流式细胞仪(FCM)从蛋白质水平检测了38例过敏性紫癜(HSP)患儿(其中11例诊断为紫癜性肾炎)和20例正常儿童PBMC中B7-1、B7-2和CD28的表达,并分析其与24 h尿微量白蛋白的关系。结果过敏性紫癜患儿B7-2蛋白和CD28蛋白的表达水平(相对平均荧光强度,RMFI)均高于正常对照组(P<0.05),各组间B7-1蛋白表达水平的差别无显著性意义(P>0.05)。18例24 h尿微量白蛋白(24h UMA)增高的HSP患儿共刺激分子B7-2、CD28蛋白的表达与24 h UMA呈等级正相关。结论过敏性紫癜患儿PBMC共刺激分子B7-2、CD28表达异常增加,可能参与HSP的起病,而且B7-2、CD28蛋白的表达与24 h尿微量白蛋白呈等级正相关,提示可以作为监测HSP患儿病情以及检测早期肾脏损害的免疫学指标。

CD1_D基因与B7-1基因共转染胰腺癌细胞及其抗癌作用的实验研究

目的观察共转染小鼠B7-1和CD1D基因对小鼠胰腺癌细胞的免疫应答。方法将表达B7-1和CD1D基因的逆转录病毒载体导入包装细胞系,然后转染入胰腺癌细胞。用PCR和Western方法鉴定细胞表达;用B7-1和CD1D阳性的细胞在体内诱导抗肿瘤免疫反应。结果B7-1和CD1D阳性的细胞在同基因小鼠体内能诱导抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长。结论B7-1基因和CD1D基因共转染肿瘤细胞,能抑制肿瘤生长,可能为肿瘤的基因治疗开辟一条新途径。

小鼠B7-1cDNA克隆、测序、表达及其抗瘤效应的初步探讨

用反转录ＰＣＲ的方法，从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ后，插入ｐｃＤＮＡ３质粒中构建成小鼠Ｂ７－１ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐＣＤ－ｍＢ７．１，经酶切鉴定和序列分析证实此表达载体中插入的Ｂ７－１ｃＤＮＡ的序列与文献报道一致．通过脂质体介导将ｐＣＤ－ｍＢ７．１导入Ｂ７－１的小鼠黑色素瘤细胞系Ｂ１６（Ｆ０）中，经ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＮＡ斑点杂交初步证实Ｂ７－１在肿瘤细胞中获得了稳定有效的表达．同源小鼠脾淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养后采用ＬＤＨ释放改良法测定淋巴细胞特异杀伤活性，结果显示，与野生型和模拟转染的Ｂ１６细胞相比，Ｂ７－１基因转染的Ｂ１６细胞能较有效诱导淋巴细胞产生针对野生型Ｂ１６细胞的特异杀伤活性（ｐ＜０．０２）．这说明，将Ｂ７－１基因导入肿瘤细胞表达能提高其免疫原性。

人B7-1和B7-2cDNA的克隆及鉴定

目的 :为探索性构建全新型重组人B7 PE40绿脓杆菌外毒素融合蛋白以长期诱导免疫耐受 ,本研究从急性B淋巴细胞白血病细胞株Raji中克隆N 末端分别缺失 34和 1 6个氨基酸的人B7 l和B7 2基因胞外区 ,并构建含此基因的重组质粒。方法 :根据B7 1和B7 2基因序列设计合成可扩增B7 1和B7 2cDNA的特异性引物 ,用RT PCR的方法从Raji细胞总RNA中扩增B7 1和B7 2cDNA ,并克隆至 pGEM T载体中 ,经酶切鉴定后再进行序列分析。结果和结论 :从Raji细胞中扩增出预期的 6 2 4和 6 75bp的B7 1和B7 2cDNA ,将其克隆至 pGEM T载体中 ,分别经EcoRI/HindⅢ和BamHI/Sphl双酶切电泳和序列分析确证 ,为进一步构建人B7

门静脉高压症患者脾切除后外周血B7-1/CD28表达的变化

目的探讨B7-1/CD28对门静脉高压症(portal hypertension,PHT)患者免疫功能的影响和作用。方法采用流式细胞分析技术对30例门静脉高压症患者进行研究,检测门静脉高压症患者行脾切除前后外周血淋巴细胞中以及脾脏中B7-1/CD28的表达情况,分析其与患者淋巴细胞亚群以及免疫功能的关系。对患者外周血B7-1/CD28和淋巴细胞进行检测。利用免疫组化方法检测B7-1/CD28在脾脏中的表达,与10例外伤性脾破裂行脾切除之脾脏组织进行比较。结果门静脉高压症患者外周血中淋巴细胞亚群和B7-1/CD28表达较低,脾切除后短期内升高。其脾脏中表达的B7-1/CD28较正常人群高。结论门静脉高压症患者全脾切除后外周血B7-1/CD28通路被激活,患者免疫功能得到部分恢复。

抗奥合剂通过p38 MAPK/NF-κB信号通路和ACE2/Ang1-7/Mas轴缓解急性肺损伤研究

目的探讨抗奥合剂(KAHJ)治疗小鼠急性肺损伤(ALI)的作用及机制,为其可能作为缓解新型冠状病毒(COVID-19)感染后症状的药物提供依据。方法采用网络药理学方法预测KAHJ治疗ALI的主要活性成分、潜在靶点和相关信号通路。将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、LPS组和LPS+KAHJ组。LPS+KAHJ组小鼠灌胃KAHJ(4.76 g·kg^(-1)·d^(-1),8.8 mL·kg^(-1)·d^(-1)),其余组小鼠灌胃生理盐水(8.8 mL·kg^(-1)·d^(-1))。14 d后,腹腔注射LPS(5 mg·kg^(-1))诱导ALI模型。收集小鼠血清和肺组织,通过组织病理学观察肺组织的病理变化。采用Western blot、qPCR、ELISA和IHC等方法评估KAHJ对ALI的改善作用。结果通过网络药理学筛选出疾病和药物共同的70个核心靶基因,并显示与多个信号通路密切相关,如MAPK、NF-κB、Apoptosis、COVID-19和肾素-血管紧张素系统(Ras)信号通路等。此外,通过实验验证发现KAHJ能改善小鼠ALI后的炎症和细胞凋亡,减少肺损伤和肺水肿,抑制肺纤维化。同时,KAHJ的作用机制与p38 MAPK和NF-κB的磷酸化以及ACE2/Ang1-7/Mas轴的调控也有着密切关系。结论KAHJ可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路和调控ACE2/Ang1-7/Mas轴缓解ALI,为缓解COVID-19感染后症状提供了补充和替代药物。

人B7-1基因的cDNA克隆及其重组腺病毒载体制备

目的 :构建并制备含人 B7- 1基因的重组腺病毒 (Ad- B7- 1)载体 ,为后续的肿瘤基因治疗研究提供实验基础。方法 :应用逆转录 -套式 PCR方法从人骨髓细胞中克隆 B7- 1的 c DNA后 ,将其克隆至小片段腺病毒载体 p CI′中 ,后者与 p HBG10在 2 93细胞内重组包装产生腺病毒 ,感染 SGC790 1细胞。结果 :成功克隆了人 B7- 1的 c DNA并构建 Ad- B7- 1载体 ,且经过酶切鉴定和测序验证。感染 Ad- B7- 1的细胞经 PCR鉴定 ,表明 B7- 1基因已整合入细胞基因组。 结论 :本实验构建的腺病毒载体可有效地转 B7- 1基因进入肿瘤细胞 ,该结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了实验基础。

人B7-1 cDNA的克隆及鉴定

目的:克隆人B7-1全长cDNA以构建相应腺病毒表达载体。方法:根据B7-1基因序列设计并合成可扩增B7-1 cDNA的特异性引物,用RT-PCR法从骨髓细胞总RNA中扩增B7-1 cDNA,并克隆至pGEM-T载体中,经酶切鉴定后再行序列分析。结果:逆转录多聚酶链反应扩增产物长度与预期的889 bp一致;用M13正、反向引物行序列测定,证实克隆出的序列与GenBank的B7-1 cDNA序列完全一致;人B7-1全长cDNA被成功地插入到质粒pGEM-T中。结论:克隆人B7-1全长cDNA为构建相应腺病毒表达载体及应用B7-1行肿瘤免疫基因治疗提供了可能性。

CD1_D基因与B7-1基因真核表达载体的构建

目的构建表达小鼠CD1_D基因和B7-1基因的真核表达载体。方法用PCR方法获得基因,定向克隆连接到真核表达载体上,得到重组真核表达载体,使用酶切方法加以鉴定。结果酶切得到的片段与所需相符,得到重组的逆转录病毒载体。结论重组小鼠CD1_D基因和B7-1基因真核表达载体的构建为今后进一步的研究奠定了基础。

IFN-α1b+5-Fu对胃癌患者CD4/CD8,NK细胞与MG_7的影响及生存率变化

目的动态观察手术、化疗、免疫制剂对围手术期胃癌患者免疫功能的影响,并通过远期随访,探讨干扰素α1b(IFN-α1b)在胃癌综合治疗中的作用。方法获根治的49例胃癌患者分为:A组(单纯手术组,术前7天至术后4周内未给予化疗或IFN-α1b,10例);B组(化疗组,应用5-Fu,18例);C组(免化组,5-Fu+IFN-α1b,21例)。分别于术前,术后2周、4周、6周检测T细胞亚群(CD4、CD8)及NK细胞,监测肿瘤标志(TMs,包括胃癌抗原MG7、CEA、CA19-9),并对部分病例(应用IFN-α1b的IFN组,12例;对照组CTL组,包括单纯手术组及化疗组,11例)随访。结果胃癌患者术前免疫功能降低,术后短期内进一步削弱;化疗可损害免疫功能,加用IFN-α1b治疗6周以上可减轻免疫损伤;MG7的阳性率是69.4%,可作为判断预后的指标;术前TMs升高者术后短期内MG7下降,如联检则部分患者于术后3月TMs再度升高,但组间无差别;IFN组与CTL组的中位生存时间分别为44个月及30个月,但组间无差异(P=0.5641)。结论IFN-α1b可减轻化疗对机体的免疫损伤,但需较长时间才能发挥作用;IFN-α1b对胃癌患者的生存时间无明显影响;MG7在胃癌术后监测及随访方面有肯定价值。