B7-2基因工程抗体的制备及体内外抗B淋巴瘤作用研究

构建B7-2人-鼠嵌合抗体基因表达质粒pIRES/ch3C8,经脂质体法转染真核表达细胞株CHO制备B7-2人-鼠嵌合抗体(命名为ch3C8)。该抗体能够识别人恶性B淋巴瘤细胞株Raji表面的B7-2分子并诱导其凋亡。ch3C8结构中来源于人Ig的Fc段可介导高效的ADCC及CDC效应。经ch3C8结合的Raji细胞接种于BALB/c裸鼠后的致瘤性消失。该抗体在B7-2相关肿瘤的生物治疗中具有潜在的应用价值。

鼠抗人B7-2单克隆抗体的研制及生物学特性研究

以天然高表达膜型B7-2分子的人恶性B淋巴瘤经胞株Daudi和B7-2基因转染细胞株L929-B7-2为免疫原及检测细胞株,采用B细胞杂交瘤技术建立了1株稳定分泌抗人B7-2单抗的杂交瘤,命名为6A5。快速定性试纸法鉴定6A5属小鼠IgG1亚类。经体内诱生腹水法制备单抗,小鼠腹水形成的阳性率为80%,腹水的收获量平均为5.9 ml/只小鼠。经免疫亲和层析法纯化,腹水中抗体蛋白的得率为1.1 mg/ml。采用间接免疫荧光法及流式细胞仪分析,单抗6A5与L929-B7-2、PBTC、Raji和Daudi的阳性结合率分别为99.9%、4.6%、90.6%和99.1%。将6A5(终浓度为5μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,6A5对Daudi细胞的生长在24 h内具有抑制作用(P<0.05)。以丝裂霉素处理的L929-B7-2为刺激细胞,PBTC为反应细胞,加入6A5共同培养。经MTT法分析,6A5能阻断B7-2介导的协同刺激信号,抑制PBTC增殖(P<0.05)。提示6A5是一株功能性抗体,在B7-2分子相关的基础和应用研究中具有重要的价值。

分子佐剂C3d上调Raji细胞协同刺激分子B7-1和B7-2的表达(简报)

我们在以往研究中，引入选择性增强体液免疫效应的新型分子佐剂C3d，成功构建了重组避孕疫苗hCGβ-C3d3，通过免疫Th2型优势的BALB／c小鼠和Th1型优势的C57BL／6小鼠．显示分子佐剂C3d在不同品系小鼠均使免疫效应从Th1型细胞免疫向Th2型体液免疫偏倚。

人B7-2和增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建

目的 构建含人B7- 2与增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体p EGFP- N3- B7- 2。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增到人B7- 2 c DNA基因片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒p GEM- Teasy和p EGFP- N3上。结果 通过酶切和序列分析证实插入片段序列正确。结论 应用基因工程技术构建成功p EGFP- N3- B7- 2融合基因表达载体,为增强型绿色荧光蛋白作为人B7- 2生物标记分子,转染肿瘤细胞及树突状细胞制备疫苗奠定了基础。

川芎嗪对活动期狼疮性肾炎外周血单个核细胞B7-1和B7-2mRNA表达的影响

目的 :探讨川芎嗪对活动期狼疮肾炎 (LN)外周血单个核细胞 (PBMC)的B7- 1(CD80 )和B7- 2 (CD86 )mRNA表达的影响 ,为临床使用川芎嗪治疗LN提供理论依据。方法 :取活动期LN患者PBMC培养 ,分别以川芎嗪、地塞米松和川芎嗪 +地塞米松进行处理 ,以PBS对照 ,采用半定量反转录PCR的方法 ,检测PBMC的B7- 1和B7- 2mR NA表达。结果 :与对照组相比 ,川芎嗪组和地塞米松组均能明显抑制B7- 2mRNA表达 (P <0 .0 5 ) ,而川芎嗪 +地塞米松组对B7- 2mRNA表达的抑制更加明显 (P <0 .0 1)。各组对B7- 1mRNA表达均无显著影响 (P >0 .0 5 )。结论 :川芎嗪能下调活动期LN外周血单个核细胞B7- 2mRNA表达 ,合并使用地塞米松能更好地抑制B7- 2mRNA表达。

B7-1与B7-2对调节人IL-2基因的转录因子NF-κB和AP-1的相同作用

为了解B7共刺激对细胞因子 ,特别是对IL 2mRNA及转录因子NF κB和AP 1的影响 ,探讨B7介导的IL 2调节的分子机制 ,在异基因混合淋巴细胞反应 (MLR)体系中分别或联合加入抗B7 1、抗B7 2单克隆抗体和CTLA 4Ig以阻断B7/CD2 8信号传导 ,通过竞争性PCR定量检测其对IL 2和IL 4mRNA的影响 ,并初步测定IFN γmRNA的改变 ,同时用转染MHCⅡ类分子及联合转染等量B7 1或B7 2的NIH3T3转基因细胞tDR7,tDR7/B7 1和tDR7/B7 2刺激CD2 8+ T细胞 ,通过DNA 蛋白结合实验观察B7对IL 2转录因子NF κB和AP 1的影响。结果表明 :抗B7 2单抗和CTLA 4Ig可明显抑制B7介导的IL 2和IL 4mRNA合成 ,而抗B7 1单抗仅有轻度抑制作用 ,2种或 3种抗体联合应用时抑制作用相加。MLR 1 - 6小时 ,单独tDR7即可诱导NF κB的表达 ,联合转染B7早期对其结合活力无明显影响 ,6小时后tDR7诱导作用减弱 ,B7却可显著延长tDR7的诱导作用至 72小时。tDR7早期同样可诱导AP 1的表达 ,联合转染B7分子在 2 4小时内对其有一定的抑制作用 ,而在反应后期可延长tDR7对AP 1的上调作用 ,B7 1与B7 2间作用未见明显不同。结论 :B7通过减少IL 2mRNA降解和影响基因转录而上调IL 2分泌 ,并可同时影响多种细胞因子分泌 ;在转录水平B7 1与B7 2作用未见明显不同 。

人B7-2基因修饰的食管癌细胞瘤苗抗肿瘤的免疫效应

目的:研究人B7-2基因修饰的食管癌细胞作为瘤苗的抗肿瘤作用。方法:将真核荧光表达载体pEGFP-C3-B7-2,通过脂质体转染技术转染人食管癌细胞株EC9706。外周血来源的树突状细胞(DC)负载肿瘤抗原后,与自体T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对转染和未转染pEGFP-C3-B7-2的人食管癌细胞EC9706的杀伤活性。结果:CTL对转染pEGFP-C3-B7-2的肿瘤细胞的杀伤活性大于转染pEGFP-C3和未转染细胞的杀伤活性(P<0.05)。结论:人B7-2基因修饰的EC9706肿瘤细胞瘤苗,可诱导出明显的抗EC9706细胞的免疫效应。

共刺激分子B7-2对小鼠肝癌治疗作用的实验研究

目的 :应用转染有小鼠B7- 2基因片段的肝癌细胞 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠肿瘤生长和消退情况 ,研究共刺激分子B7- 2对肿瘤的免疫治疗作用。方法 :建立BALB/c小鼠转B7- 2基因肝癌细胞株H2 2 /B7- 2 ,细胞计数法测定肿瘤细胞体外增殖能力 ;BALB/c鼠皮下接种H2 2 /B7- 2及野生型H2 2细胞H2 2 /Wt,以空载体转染细胞H2 2 /neo为对照 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小 ;同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养 (MTLCs)后测定淋巴细胞增殖指数和CTLs活性 ,同时测定培养上清IL -2、IFNγ ,研究B7- 2分子的抗肿瘤免疫效果。结果 :细胞在体外增殖能力一致 (P =0 .782 ) ;当接种不同肿瘤细胞后 ,三组动物都发生肿瘤 ,接种H2 2 /B7- 2组肿瘤形成有迟发性 ,并在接种 18d后肿瘤都开始缩小 ,但最终不会完全消失 ;接种H2 2 /Wt和H2 2 /neo组动物肿瘤呈进行性生长。H2 2 /B7- 2在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显强于对照细胞 (P <0 .0 5 )。结论 :共刺激分子B7- 2能增强肝癌细胞的免疫原性 ,它在抗肿瘤早期发挥作用。用其治疗肝癌是有效的 ,但不能介导完全和长期的抗肿瘤效应。

编码人B7-2胞外区cDNA的克隆、表达及生物活性鉴定

B7 2分子是共刺激信号系统B7/CD2 8/CTLA 4中的重要成员之一 ,为了更深入地探讨B7 2分子在调控T细胞增殖、分化及相关信号传导过程中的作用 ,本研究通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增编码人B7 2分子胞外区的cDNA ,测序后定向插入多个原核表达载体并诱导目的蛋白表达 ,用Western印迹和MTT鉴定生物活性。结果表明 :通过pGEX 4T 2载体实现了在宿主菌BL 2 1 (DE3) codenplus RIL中较高水平的表达 ,蛋白表达量为 2 0 %。经Western印迹和MTT鉴定 ,所表达及初步纯化的B7 2胞外区重组蛋白能与抗人B7 2单抗发生特异性结合 ;在抗人CD3单抗的协同下 ,B7 2胞外区重组蛋白能有效地促进外周血单核细胞的增殖。结论 :B7 2胞外区重组蛋白的获得为进一步研究B7

鼠抗人B7-2分子单链抗体基因的构建及其在家蚕中的表达

B7-2蛋白为免疫球蛋白超家族(IGSF)成员之一。采用PCR法从分泌鼠抗人B7-2抗体的杂交瘤细胞株克隆出该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,在VH和VL可变区基因间引入连接肽(Gly4Ser)3编码序列,体外构建抗人B7-2的鼠源单链抗体基因B7-2-ScFv。利用新型杂交病毒HyNPV的Bac-to-Bac表达系统,将B7-2-ScFv基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFastBacHTa-B7-2-ScFv,转化大肠杆菌DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-B7-2-ScFv。将此重组杆粒的DNA转染Sf9细胞,获得重组病毒HyNPV-ScFv。感染该重组病毒的BmN细胞经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,至感染24h时目的蛋白已有表达,96h达到最高表达水平,表达产物的分子质量约31kD。用该重组病毒感染家蚕5龄起蚕,感染后96h蚕体表现出明显的发病症状。RT-PCR结果表明,5龄起蚕感染后48h,在脂肪体内已有目的基因转录,一直持续到感染后120h;SDS-PAGE和Western blotting分析表明,5龄起蚕感染96h后方可在脂肪体中检测到目的蛋白表达。构建并在家蚕中成功表达鼠抗人B7-2单链抗体,为深入研究和开发该抗体奠定了基础。

过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞共刺激分子B7-1、B7-2与CD28的表达及意义

目的探讨免疫共刺激分子B7-1、B7-2和CD28在过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其意义。方法应用流式细胞仪(FCM)从蛋白质水平检测了38例过敏性紫癜(HSP)患儿(其中11例诊断为紫癜性肾炎)和20例正常儿童PBMC中B7-1、B7-2和CD28的表达,并分析其与24 h尿微量白蛋白的关系。结果过敏性紫癜患儿B7-2蛋白和CD28蛋白的表达水平(相对平均荧光强度,RMFI)均高于正常对照组(P<0.05),各组间B7-1蛋白表达水平的差别无显著性意义(P>0.05)。18例24 h尿微量白蛋白(24h UMA)增高的HSP患儿共刺激分子B7-2、CD28蛋白的表达与24 h UMA呈等级正相关。结论过敏性紫癜患儿PBMC共刺激分子B7-2、CD28表达异常增加,可能参与HSP的起病,而且B7-2、CD28蛋白的表达与24 h尿微量白蛋白呈等级正相关,提示可以作为监测HSP患儿病情以及检测早期肾脏损害的免疫学指标。

小鼠B7-2基因的克隆、测序及其重组质粒的构建

目的 :克隆小鼠 B7- 2基因编码区的 c DNA序列 ,并构建其表达载体。方法 :利用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)法 ,以小鼠脾细胞 m RNA为模板 ,扩增获得 B7- 2基因 ,与 p MD- 1 8T连接做全自动测序 ,并利用基因重组技术构建包含 B7- 2基因的表达质粒 pc DNA3.1 - CMV- B7- 2及 pc DNA3.1 - Egr- B7- 2。结果 :经测序证实获得的 B7- 2基因与文献报道的基本一致 ,并成功地构建了表达质粒。结论 :成功克隆了 B7- 2的编码基因 ,并成功构建了表达载体 pc DNA3.1 - CMV- B7- 2及 pc DNA3.1 - Egr- B7-

X射线对小鼠腹腔巨噬细胞表达B7-1和B7-2的影响

目的 :观察 X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 1和 B7- 2的影响。方法 :采用免疫组织化学法 ( ABC法 )。结果 :小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 2达到高峰的时间早于 B7- 1,而且 B7- 2表达幅度也高于 B7- 1。剂量 -效应关系的研究表明 ,B7- 1和 B7- 2的表达均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时也出现一个峰值。但在不同分度分析结果中发现 ,低剂量 X射线照射组的高密度细胞百分数比较大剂量组多。结论 :B7分子的表达上调可能是参与低剂量电离辐射免疫增强效应的重要因素。

重组B7-2腺病毒载体的构建及其诱导小鼠抗肝癌免疫的初步研究

探讨重组腺病毒介导的Ｂ７２基因转染对小鼠肝癌细胞免疫原性的影响。构建Ｂ７２的重组腺病毒载体，通过重组腺病毒介导，将Ｂ７２和ｌａｃＺ基因分别转染小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａ１６，并在不同时相检测Ｂ７２和ｌａｃＺ基因的表达水平，建立小鼠肝癌肿瘤模型，在小鼠体内观察Ｂ７２基因转染对小鼠肝癌免疫原性的影响。成功地构建了Ｂ７２的重组腺病毒载体，用Ｂ７２及ｌａｃＺ重组腺病毒分别转染小鼠肝癌细胞，转染后４ｈ开始检测到Ｂ７２或ｌａｃＺ表达，其表达量逐渐升高至４８～７２ｈ达高峰后逐渐降低。经２次／ｗ肿瘤内注射，共５次Ｂ７２治疗后，肝癌体积明显缩小，与对照生理盐水组及ｌａｃＺ组相比，有显著差异。小鼠肝癌组织中Ｂ７２的表达能增强其免疫原性，减少其致瘤性。

人B7-1和B7-2cDNA的克隆及鉴定

目的 :为探索性构建全新型重组人B7 PE40绿脓杆菌外毒素融合蛋白以长期诱导免疫耐受 ,本研究从急性B淋巴细胞白血病细胞株Raji中克隆N 末端分别缺失 34和 1 6个氨基酸的人B7 l和B7 2基因胞外区 ,并构建含此基因的重组质粒。方法 :根据B7 1和B7 2基因序列设计合成可扩增B7 1和B7 2cDNA的特异性引物 ,用RT PCR的方法从Raji细胞总RNA中扩增B7 1和B7 2cDNA ,并克隆至 pGEM T载体中 ,经酶切鉴定后再进行序列分析。结果和结论 :从Raji细胞中扩增出预期的 6 2 4和 6 75bp的B7 1和B7 2cDNA ,将其克隆至 pGEM T载体中 ,分别经EcoRI/HindⅢ和BamHI/Sphl双酶切电泳和序列分析确证 ,为进一步构建人B7

肾移植急性排斥反应时B7-2/CD28信号通路的表达

背景:以往动物研究表明,在器官移植急性排斥反应时共刺激分子的表达与急性排斥反应密切相关。目的:观察急性排斥反应时患者移植肾脏组织和外周血中B7-2/CD28信号通路的表达。方法:对53例同种异体肾移植患者于移植前1d、移植后1,3,7,14,21,28d分别取外周血以及在临床诊断急性排斥反应当天和抗排斥治疗1周后额外采血,用流式细胞仪检测共刺激分子B7-2/CD28在外周血淋巴细胞中的表达;同时,行经皮肾穿刺活检供肾修整结束时、移植后7d、1个月、6个月、1年或以上获取活检肾脏组织,用免疫组织化学方法检测活检组织中B7-2/CD28的表达情况。结果与结论:移植后1,3d内所有患者外周血中CD28+,CD4+/CD28+,CD8+/CD28+细胞比率均有显著下降(P<0.05),一二周后恢复到术前水平;移植后7d未发生急性排斥反应的患者肾脏组织B7-2阳性表达率显著上升(P<0.05),1个月后下降至移植前水平(P>0.05)。移植后发生急性排斥反应的患者外周血CD28+,CD4+/CD28+,CD8+/CD28+细胞比率及肾脏组织B7-2阳性表达率明显上升(P<0.05),经抗排斥治疗1周后均好转。结果证实,在肾移植后出现急性排斥反应时,肾脏组织以及外周血中共刺激分子B7-2/CD28的表达上调与急性排斥反应的发生密切相关。

新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化

为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结果表明,在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈,结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性,从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀。在蓝染料亲和层析一步分离中,由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多,极难区分目的蛋白和杂蛋白。但是,PRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10,可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸,这十分有利于通过Ni-NTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物。根据这一特性,经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线,用于纯化分离B7-2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的纯度可达95%以上,总回收率为8%。Western-blot实验显示,所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合;MTT生物活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用,而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用。结论:建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线,所纯化的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞。

B7-2基因联合自杀基因治疗乳腺癌移植瘤模型

目的观察树突状细胞活化抗原B7-2基因联合自杀基因系统EC-CD/5-FC于实验性乳腺癌的体、内外治疗的协同作用。方法用重组腺病毒构建CD和B2-7载体,体外感染人乳腺癌MCF-7细胞,荧光显微镜观察其感染率。然后给与前药5-FC,通过MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况;Annexi V-FTTC/PI双染流式细胞术检测MCF-7细胞的细胞周期。BALB/C小鼠腋窝下注射MCF-7细胞制备乳腺癌移植瘤模型,待肿瘤直径达0.5 cm大小,分别在肿瘤局部直接注射Ad CD/B7-2,然后连续10 d腹腔注射5-氟胞嘧啶(5-FC),免疫组化法检测肿瘤组织中CD8+T表达。结果 MTT法检测显示MCF-7细胞对前药有较高的敏感性,Ad CD/5-FC/Ad B7-2和Ad CD/5-FC组MCF-7细胞的增殖均受到明显抑制(P<0.05);而Ad B7-2治疗基因对MCF-7细胞的增殖没有任何影响。在感染复数为100时流式细胞仪检测,Ad CD/5-FC/Ad-B7-2组和Ad CD/5-FC组均出现典型的凋亡峰,细胞周期分析显示治疗后G0~G1期比率增多,G2~M及S期细胞减少。在MCF-7移植瘤模型中,Ad CD/5-FC/Ad-B7-2治疗后移植瘤的生长明显受到抑制;肿瘤瘤体内或瘤体周围CD8+T细胞浸润增加。结论 B7-2联合自杀基因系统对乳腺癌MCF-7细胞及其MCF-7细胞移植瘤均有明显的抑制作用,B7-2联合自杀基因Ad CD/5-FC系统时,共刺激分子B7-2可通过增强和诱导的特异抗肿瘤免疫,有效减少肿瘤负荷,增强Ad-CD/5-FC系统对肿瘤的杀伤作用。

重组B7-1/B7-2逆转录病毒载体的构建及其在小鼠肝癌基因治疗中的应用

目的构建表达Ｂ７－１／Ｂ７－２的重组逆转录病毒载体，并观察Ｂ７－１／Ｂ７－２的表达对体内外抗小鼠肝癌免疫反应的影响。方法粘端定向克隆构建重组逆转录病毒载体ＬＸＳＮ－ｍＢ７－１和ＬＸＳＮ－ｍＢ７－２，依次转导包装细胞系ＰＥ５０１和ＰＡ３１７，并用重组病毒上清感染小鼠肝癌细胞系Ｈｅｐａｌ－６，流式细胞术检测Ｂ７－１／Ｂ７－２的表达，并用Ｂ７－１／Ｂ７－２表达阳性的Ｈｅｐａｌ－６在体内外诱导抗肿瘤免疫反应。结果１．表达Ｂ７－１／Ｂ７－２阳性的Ｈｅｐａｌ－６致瘤性明显降低；２．单独Ｂ７－１／Ｂ７－２基因转染仅能诱导部分细胞毒性和部分保护性免疫反应；３．Ｂ７－１／Ｂ７－２基因转染与细胞因子处理联合应用则能诱导强烈的细胞毒性和完全的抗Ｈｅｐａｌ－６保护性免疫反应。结论Ｂ７－１／Ｂ７－２共刺激分子在小鼠肝癌的表达是激活抗肿瘤免疫所必需的但不是充分的条件。

双表达B7-1、B7-2基因肿瘤疫苗治疗小鼠肝癌优于单表达疫苗的研究

目的:研究B7-1、B7-2基因对肿瘤的免疫治疗作用。方法:应用转染有B7-1、B7-2基因的肝癌细胞株H22/B7-1、H22/B7-2,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小。结果:各实验组动物都发生肿瘤,接种H22/B7-1+H22/B7-2组成瘤率低,对照组动物肿瘤呈进行性生长;组间成瘤潜伏期不同,与对照组相比,凡接种有H22/B7-2的小鼠肿瘤形成有迟发性;接种转B7基因细胞的小鼠肿瘤生长都较对照组慢;同时接种H22/B7-1和H22/B7-的小鼠能负载大于107的肿瘤细胞。转基因细胞在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显增强。结论:B7-1、B7-2都能增强肝癌细胞的免疫原性。B7-2在抗肿瘤早期发挥作用,B7-1随后起放大和调节作用。B7-1与B7-2联用效果优于单一应用。