基于BAF/GM细胞株法检测生长激素生物活性研究

目的探讨基于BAF/GM细胞株法检测生长激素(GH)生物活性的可行性,为临床检测GH生物活性提供参考方法。方法选取2011年7月—2013年12月新疆医科大学第一附属医院儿科收治的特发性身材矮小(ISS)患儿42例(ISS组),另选取同期本院预防保健科体检健康儿童52例(对照组)。建立BAF/GM细胞株,常规培养于DMEM高糖培养基。培养液洗涤后转移到含10%马血清的培养基中培养16 h。采用含10%马血清的培养基重悬细胞,调整细胞浓度为3×10~5个/ml,混匀后取100μl滴在96孔板中。稀释标准GH溶液至终浓度为0.01~1 000.00μg/L,取10μl标准GH溶液滴加到96孔板中,培养22 h。每孔加入22μl反应液,继续培养3 h,在490 nm处测定吸光度(OD)值。绘制OD值与GH生物活性当量关系的标准曲线。采用含10%马血清的培养基配制促甲状腺激素(100 m U/L)、黄体生成素(10 000 U/L)、卵泡刺激素(10 000 U/L)、催乳素(100 U/L)、成纤维细胞生长因子(1 000μg/L)、表皮生长因子(100μg/L)、人类胰岛素样生长因子1(IGF-1,10μg/L)、氢化可的松(100μg/L)、诺和灵R(1.0 U/L)、L-甲状腺素钠(643.5 nmol/L),同时每孔加标准GH溶液5μl(20μg/L)进行干扰实验。采集两组受试者空腹静脉血,采用放射免疫分析法(IRMA)测定血清GH水平;灭活血清标本,以MTS法测定490 nm处OD值,代入标准曲线计算血清GH生物学活性当量。结果 GH生物活性当量与OD值关系的标准曲线为Y=0.8520ln(X)+0.498 8,R^2=0.969 8,其中X为GH生物活性当量,Y为OD值。加入促甲状腺激素、黄体生成素、卵泡刺激素、催乳素、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、IGF-1、氢化可的松、诺和灵R和L-甲状腺素钠后测得OD值分别与标准GH溶液比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。两组受试者GH水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。ISS组GH生物活性当量、GH生物活性低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论基于BAF/GM细胞株法是潜在的检测GH生物活性的良好方法,且具有一定的抗干扰能力。

BAF/GM细胞株法在生长激素生物测定中的应用

目的探讨BAF/GM细胞株法测定正常儿童及特发性身材矮小患儿生长激素生物活性中的应用,为特发性身材矮小的病因学研究提供一定的实验依据。方法采用BAF/GM细胞株法建立体外生物测定系统,测定正常组儿童及特发性身材矮小患儿生长激素生物活性,同时采用免疫放射分析法测定其免疫活性。通过加入胰岛素、胰岛素样生长因子等评估该检测方法的稳定性,分析其对生长激素的阻断作用。结果 (1)生长激素刺激BAF/GM细胞株的增殖呈剂量依赖性。(2)两组儿童血清生长激素生物活性和免疫活性比较差异均无统计学意义(P1=0.393,P2=0.54)。(3)游离胰岛素样生长因子在浓度>30ng/mL时刺激细胞增殖,且增殖呈剂量依赖性,其余生长因子对细胞增殖无影响。结论 BAF-GM细胞株法测定生长激素生物活性具有较好的敏感性与特异性,是分析血清样本中生长激素的生物活性水平的一种切实可行方法。

转FL、GM-CSF基因的人骨髓基质细胞促进脐血CD34^+细胞体外扩增

研究转FL、GM CSF基因的基质细胞对脐血CD34+ 细胞的扩增效应。将转FL、GM CSF基因的人骨髓基质细胞系与脐血CD34+ 细胞共培养 ,观察细胞总数、CD34+ 细胞数、CFU GM的变化情况。培养到第 4周时 ,第 (4 )组 (SCF+IL 3+IL 6 +GM CSF +FL)和第 (8)组 (HFCL/hGM CSF +HFCL/hFL +SCF +IL 3+IL 6 )的细胞总数增加到最大 ,分别扩增了 717± 2 4 4 7和 70 9± 6 3 6 3,第 1周 ,第 (5 )组 (HFCL +SCF +IL 3+IL 6 )扩增了 10 5± 2 0 8倍 ,较第 (8)组减少 (P <0 0 5 )。第 1周时 ,CD34+ 细胞总数第 (4 )组和第 (8)组分别扩增了 8 4 4倍和 11 5倍 (P <0 0 5 ) ,CD34+ 细胞百分率第 (7)组 (FCL/hFL +SCF +IL 3+IL 6 )为 5 0 2 % ,第 (6 )组 (HFCL/hGM CSF +SCF +IL 3+IL 6 )为 2 8 95 % (P <0 0 1)。第 2周 ,各组CFU GM增加显著 ,以第 (4 )组和第 (8)组增加最为明显 ,以后随扩增时间延长 ,造血细胞集落数、集落体积逐渐减少。表明转FL、GM CSF基因的基质细胞 ,能有效的协同其他细胞因子对脐血CD34+ 细胞产生明显的扩增作用 。

B_3HM细胞匀浆第3组分对照射小鼠的骨髓细胞及人GM-CSF依赖细胞系MO7e增殖的影响<英文>

B_3HM细胞系可以致小鼠白血病。为了进一步寻找致病物质,将B_3HM细胞经超声波匀浆后,差速离心分成四个组分,分别注射于经^(137)Cs 4.5 Gy照射的615或BALB/c小鼠。结果显示,第3组分含致病活性物质。经与B_3HM细胞第3组分共孵育后的MO7e细胞对GM-CSF依赖性明显减弱,并能生成自发性L-CFU。在SDS-PAGE胶上B_3HM细胞第3组分显示一条分子量约36kD的蛋白带。经制备电泳分离的5条蛋白带中3条带对GM-CSF因子依赖细胞系MO7e有一定促增殖作用。B_3HM细胞使经照射处理的小鼠血细胞发生恶性转化的活性物质可能与这些表达蛋白有关。

联用重组的IL-3、GM-CSF对阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡的影响

为研究在阿糖胞苷（Ara－C）的作用下，基因重组的人白细胞介素3（rh－IL－3）、粒单祖细胞集落刺激因子（rh－GM－CSF）对白血病细胞凋亡的影响，选用了HL－60白血病细胞系，采用DNA电泳、流式细胞仪检测、单克隆抗体C－myc、bcl－2抗原表达的分析以及白血病细胞集落的培养观察方法，观察了0～36h8个不同时相凋亡率与其他指标的变化，表明Ara－C凋亡的作用随药物孵育时间的延长而逐渐增强，凋亡率从0h的1．5％升至36h后的36．4％，而IL－3和GM－CSF能使这种作用明显提高，使凋亡率从7．6％升至19．6％，并能增强Ara－C对白血病细胞的杀灭，引起HL－60细胞C－myc抗原表达下降，而bcl－2抗原表达变化不大，同时发现这两种细胞因子对正常造血细胞影响较小，这为临床上白血病诱导缓解期联用rh－IL－3、rh－GM－CSF和细胞毒药物，提高缓解率，提供了理论依据。

小鼠胎肝造血基质细胞系对CFU-GM生长的调控作用

利用本实验室建立的小鼠胎肝造血基质细胞系(MFLSC)研究了造血基质细胞对粒-巨噬系造血祖细胞(CFU-GM)生长的影响。实验结果表明,MFLSC对CFUGM集落的生成有双向调控作用,即既有刺激性作用,又有抑制性影响。这种调控有体液因子之中介,亦有细胞与细胞间近距离的效应。文中讨论了MFLSC双向调控CFUGM生长的意义及其机理。

应用DMSO诱导的HL60细胞检测HGM—CSF生物学活性

本文应用人髓样白血病细胞系 HL60在了 DMSO 诱导下可表达高亲和力 HGM—CSF 受体的特点,建立了 HGM—CSF 生物学检测方法。结果表明:未经诱导的 HL60细胞对 HGM—CSF 只有很低的反应性,经 DMSO 诱导的 HL60细胞对 HGM—CSF 反应性明显增加,最适诱导时间为3～5天,检测时间为36小时,细胞密度以3～6×10~4/孔为宜,检测敏感性至少可达0.3ng/ml。TPA 和细胞因子 IL—1、IL—6、IL—8.均不能促进 DMSO 诱导的 HL60细胞对 HGM—CSF 的反应性。本文还应用此检则方法对人膀胱癌细胞系U5637培养上清中 GM—CSF 的生物学活性进行了检测。

急性髓系白血病患者solGM Rα表达的研究

目的 研究可溶性人粒 -巨噬细胞集落刺激因子受体 ( sol GMRα)在急性髓系白血病 ( AML)患者中的表达及其临床意义。方法 应用酶联免疫吸附法 ( ELISA)对 5 4例 AML患者血清及 4种白血病细胞系 ( HL-60、U93 7、TF-1、K5 62 )培养上清液进行可溶性受体检测分析。结果 AML患者血清 sol GMRα水平为 83 0 3 .99± 661 1 .61 ( ng/L) ,其中M4 、M5亚型表达水平显著高于正常对照组 [( 4 0 2 7.85± 2 5 0 1 .2 6) ng/L,P<0 .0 5 ]。白血病细胞系 HL-60、U93 7、TF-1培养上清液中均有 sol GMRα表达 ,而 K5 62细胞系无表达。结论 sol GMRα在急性髓系白血病患者中存在异常高表达 ,其中以单核细胞白血病更为明显。

猪GM-CSF稳定表达细胞系的建立

旨在建立能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。本研究利用NCBI已公布猪GM-CSF基因序列设计引物,采用RT-PCR法扩增出猪GM-CSF开放阅读框(ORF)。发现其长435bp,编码144个核苷酸的蛋白。该蛋白分子质量为16.3ku,等电点为7.15。与绵羊、马、猫、牛、狗和人的同源性分别为77.1%、73.6%、72.2%、71.5%、71.3%和70.8%。通过EcoR I和BamH I酶切后,将GM-CSF基因插入pIRES2-EGFP载体中,构建出pIRES2-EGFP-pGM-CSF重组质粒。该重组质粒转染猪肠上皮细胞(IPEC-J2)后,G418筛选阳性细胞。在转染后24h,荧光定量PCR可见GM-CSF mRNA表达量较对照组及空载体组细胞显著升高(P<0.01),荧光显微镜下亦可见大量绿色荧光表达。该细胞系在含有G418的培养液中连续传代30次,仍可见GM-CSF基因和蛋白水平的高表达。本研究成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-pGM-CSF和能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。

rhGM-CSF/IL-3融合蛋白对Ara-C介导的HL-60细胞凋亡的影响

本研究采用HL-60白血病细胞系探讨了rhGM-CSF/IL-3融合蛋白对Ara-C介导的HL-60细胞凋亡的影响,结果表明,Ara-C与rhGM-CSF/IL-3联合应用处理HL-60比Ara-C单独作用更能显著提高寡核苷体DNA片段、抑制HL-60集落形成;rhGM-CSF/IL-3对Ara-C介导的HL-60细胞凋亡率的影响比不加rhGM-CSF/IL-3的对照组有明显提高,且比rhGM-CSF与rhIL-3联用作用更明显,但对正常人外周血白细胞作用较弱,提示可能对于rhGM-CSF/IL-3诱导缓解期白血病具有一定作用.

腺病毒介导多基因在胆管癌细胞中的表达

目的：研究腺病毒介导的多基因（GM－CSF、B7-1、p53、IL－2）在胆管瘤细胞系QBC939中的表达及对其生长的影响。方法：构建同时含GM－CSF、B7－1、p53、IL－24种目的基因的重组腺病毒载体Admultigenes，应用流式细胞仪、ELISA、免疫织化等方法，分析该重组腺病毒体包含的目的基因在靶细胞中的表达，并绘制细胞的生长曲线。结果：腺病毒介导的多基因在胆管癌细胞系QBC939中高效表达（IL－2不表达），并能抑制胆管瘤细胞的生长。结论：腺病毒介导的多种基因能在胆管瘤细胞QBC939中表达．并抑制肿瘤细胞的生长。

体细胞组织培养用于甘蓝型油菜核三系保持系绵7MB-1亲本繁殖与F_1制种的研究

利用自育的核三系艋保系新材料绵7MB-1，可以将油菜绵7AB类型、S45AB类型等臆性核不育两用系的不育株率从50％提高到90％以上。针对该材料在自交繁殖过程中，发生部分育性回复的现象，采用临保系植株茎段体细胞组织培养技术，实现了绵7MB-1的批量繁殖，将繁殖的临保系苗用于网室亲本不育系繁制，可使不育系亲本不育株率达到91．7％-93．5％。每繁制公顷不育系亲本，可供7500—15000hm^2杂交F1的制种生产使用。用高不育率不育系代替原核不育两系进行制种，大大减少了用工，同时使制种产量显著提高，制种质量也更有保证，形成了完善的繁殖与制种体系。

TF-1细胞增殖特性与信号蛋白JAK2/STAT3表达研究

目的 探索JAK/STAT途径活化与细胞增殖和凋亡之间的关系。方法 通过表达内源性GM CSF受体的TF 1细胞 ,观察细胞增殖与凋亡 ;建立免疫沉淀和Westernblot印迹方法 ,检测经GM CSF 10 0ng/ml瞬时诱导的TF 1细胞信号蛋白JAK2和STAT3酪氨酸磷酸化情况。结果 经过GM CSF刺激 ,细胞不但免于凋亡 ,TF 1细胞还呈现剂量与时间信赖性的增殖反应。当耗竭细胞因子 6～ 12h后 ,倒置显微镜下TF 1细胞呈现折光性改变 ,细胞开始凋亡 ,呈现凋亡特征性形态改变和出现DNA梯形条带 ,而加入 0 .1ng/ml的GM CSF ,TF 1细胞即开始进入增殖状态 ,提示GM CSF对细胞具有凋亡保护作用。经过 10 0ng/mlGM CSF的瞬时诱导 ,在分子量 130kd区域见到JAK2蛋白条带 ,显示GM CSF可诱导TF 1细胞磷酸化JAK2表达 ;而在分子量 90kd区域未见到STAT3蛋白条带 ,显示无磷酸化STAT3表达 ;而未经GM CSF诱导的TF 1细胞 ,既无磷酸化JAK2也无磷酸化STAT3表达。结论 GM CSF为TF 1细胞增殖诱导和凋亡保护所必需 ;GM CSF诱导的TF

TC-1基质细胞系对造血干、祖细胞的刺激作用

TC-1基质细胞系是从小鼠骨髓细胞长期液体培养中分离出来的细胞系,其条件培养液中具有多种生物活性物质,被认为多因子分泌的细胞系。TC-1条件培养液与正常小鼠骨髓细胞共同孵育,然后通过粒、单系祖细胞(CFU-GM)半固体培养试验,脾结节形成试验,放射保护试验及流式细胞仪测定骨髓细胞的周期特点,证实了TC-1细胞系能分泌粒、单系集落刺激活性物质(GM-CSA)及体外对多能造血干细胞具有保存作用。

不同方法诱导THP-1细胞分化效果比较

目的优化不同方法刺激THP-1细胞定向分化为M1、M2巨噬细胞及DC细胞,为M1、M2和DC三种体外细胞模型研究奠定基础。方法首先用PMA和GM-CSF/M-CSF两种方法刺激诱导THP-1细胞分化,再分别添加不同细胞因子诱导其分化为M1、M2和DC细胞,观察细胞形态的变化,并用流式细胞术检测细胞表面分子的表达情况。结果两种方法刺激细胞CD分子表达的整体趋势基本一致。THP-1-M1细胞表面CD80和CD86表达量显著增加;THP-1-M2细胞高表达CD163和CD209;THP-1-DC细胞CD14表达量显著降低,高表达CD80、CD86和CD11c。PMA刺激后,M1、M2和DC细胞均贴壁生长;GM-CSF/M-CSF刺激后,只有DC细胞部分贴壁生长,M1和M2细胞仍呈悬浮生长。结论两种方法均能成功地诱导THP-1细胞向不同细胞亚型分化,但是诱导出来的细胞在形态上存在一定差异,可根据实验需求选择刺激方法。

巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对小鼠乳腺癌4T1细胞迁移及血管内皮生长因子A表达的影响

目的 探讨巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）对乳腺癌4T1细胞迁移及血管内皮生长因子（VEGF）-A表达的影响.方法 分别用5、10 ng/ml M-CSF和GM-CSF处理小鼠乳腺癌4T1细胞株,采用实时荧光定量PCR方法检测4T1细胞中细胞因子VEGF-AmRNA表达量的变化.划痕实验和Transwell实验检测用5 ng/ml M-CSF、5 ng/ml GM-CSF和10 ng/mlVEGF-A对4T1细胞迁移和侵袭能力的影响.结果 经5、10ng/ml M-CSF分别处理4T1细胞后VEGF-AmRNA在12h和24 h的相对表达量分别为17.81±2.49和17.48±5.43、5.15±2.59和5.45±4.28;经5、10 ng/ml GM-CSF分别处理4T1细胞后VEGF-A mRNA在12h和24 h的相对表达量分别为9.77±2.39和7.61±2.80、6.53±2.41和6.30±2.89.与无细胞因子处理的对照组相比,除10 ng/ml GM-CSF处理4T1细胞24 h组VEGF-A mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）外,其他各组VEGF-A mRNA表达水平差异均有统计学意义（均P＜ 0.05）,处理细胞12h时VEGF-A的表达较24 h时更明显（均P＜ 0.01）.划痕实验显示M-CSF和GM-CSF可促进4T1细胞的迁移,但VEGF-A对4T1细胞的迁移无影响.Transwell实验发现,用M-CSF、GM-CSF和VEGF-A处理的实验组中4T1细胞的穿膜数量多于无细胞因子处理的对照组（均P＜ 0.05）.结论 M-CSF和GM-CSF可促进小鼠乳腺癌4T1细胞迁移及VEGF-A的表达.