BARF1表达下调通过活化caspase依赖的线粒体通路诱导EBV阳性胃癌细胞凋亡

目的:研究BARF1表达下调对EBV阳性胃癌细胞凋亡的影响,以及BARF1基因沉默介导细胞凋亡的分子机制。方法:siRNA和NCsiRNA分别转染NUGC3和SNU719细胞,运用Western blot测定细胞中BARF1、Bcl-2、Bax、细胞色素C、caspase 3和caspase 9的蛋白表达;RT-PCR测定BARF1、Bcl-2和Bax mRNA的表达;台盼蓝染色法测定细胞存活率;Annexin V-FITC/PI染色法和流式细胞仪测定细胞凋亡;细胞凋亡因子抗体芯片分析细胞中凋亡相关蛋白的表达;线粒体膜电位检测试剂盒测定线粒体膜电位;免疫共沉淀检测细胞中Apaf-1和caspase 9的相互作用。结果:与空白对照组和阴性对照组相比,BARF1基因沉默显著诱导NUGC3和SNU719细胞凋亡,而线粒体膜电位显著降低。BARF1沉默基因能促进促凋亡蛋白的表达并抑制抗凋亡蛋白的表达,Bcl-2/Bax比例显著降低;而caspase抑制剂能抑制由BARF1基因沉默介导的细胞凋亡。在siRNA转染的细胞中,caspase 3和caspase 9蛋白发生裂解,细胞色素C的浓度显著高于阴性对照组,Apaf-1蛋白与caspase 9蛋白在细胞质中能够发生相互作用。结论:BARF1基因沉默通过线粒体途径调节Bcl-2和Bax蛋白的表达进而诱导NUGC3和SNU719细胞凋亡,并呈caspase通路依赖关系。

EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞株SGC7910生物学行为的影响

目的:了解EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响。方法:构建pSG5/BARF1真核表达载体,转染到EB病毒阴性的胃癌细胞系SGC7901,经RT-PCR鉴定,获得BARF1稳定表达的细胞克隆。以pSG5空载体转染细胞为对照,进行细胞凋亡诱导实验、细胞增殖实验、软琼脂集落形成实验和细胞迁移实验。结果:与对照组相比,BARF1表达细胞组经抗癌药顺铂诱导后的细胞凋亡率显著降低(P<0.01),增殖速度显著加快(P<0.01),软琼脂集落形成率显著提高(P<0.05),细胞迁移能力显著增强(P<0.05)。结论:BARF1基因能够全面增强胃癌细胞的肿瘤原性,可能在EB病毒相关胃癌发生与演化的整个过程中起重要作用。

JNK/c-Jun信号通路参与介导EB病毒编码的BARF1基因上调胃癌细胞Bcl-2的表达

目的:探讨EB病毒编码的BARF1基因对胃癌细胞JNK-MAPK信号通路活性及Bcl-2基因表达的影响。方法:以p SG5空载体转染的胃癌细胞系BGC823(BGC-SG)为对照,采用蛋白质印迹分析稳定表达BARF1的BGC823细胞(BGC-BARF1)中,以及采用JNK-MAPK的特异性抑制剂SP600125处理后JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平以及cJun和Bcl-2蛋白的表达。结果:与BGC-SG相比,BGC-BARF1细胞中JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平,以及c-Jun和Bcl-2蛋白的表达均显著提高(P<0.05)。SP600125处理后,c-Jun蛋白的磷酸化水平以及c-Jun和Bcl-2蛋白的表达均显著下降。结论:JNK/c-Jun信号通路参与介导BARF1上调胃癌细胞中Bcl-2的表达。

EB病毒编码的BARF1基因通过JNK/c-Jun信号通路调节鼻咽癌细胞bcl-2的表达

目的:探讨EB病毒编码的BARF1基因对鼻咽癌细胞JNK/c-Jun信号通路活性及bcl-2表达的影响。方法:以p SG5空载体转染鼻咽癌细胞系CNE1(CNE1-SG)为对照,采用蛋白质印迹法检测稳定表达BARF1的CNE1细胞(CNE1-BARF1)中JNK/c-Jun通路的活性及BCL-2的表达;经JNK特异性抑制剂SP600125处理后,检测CNE1-BARF1细胞中JNK/c-Jun通路的活性及BCL-2的表达。结果:与CNE1-SG细胞相比,CNE1-BARF1细胞中cJun、BCL-2表达以及JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平明显增加(P<0.05)。经SP600125处理后,CNE1-BARF1细胞中c-Jun及BCL-2表达明显降低(P<0.05),c-Jun磷酸化水平也降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:BARF1基因可能通过激活JNK/c-Jun信号通路上调原癌基因bcl-2的表达。

BARF1基因对鼻咽癌细胞NF-κB信号通路及bcl-2基因表达的影响

目的:探讨EB病毒编码的BARF1基因对鼻咽癌细胞NF-κB信号通路活性及bcl-2基因表达的影响。方法:以pSG5空载体转染鼻咽癌细胞(CNE1-SG)为对照,分别采用荧光抗体染色法和蛋白质印迹法检测稳定表达BARF1的鼻咽癌细胞系CNE1(CNE1-BARF1)中NF-κB蛋白的核转位和Bcl-2蛋白的表达变化。结果:与CNE1-SG相比,CNE1-BARF1细胞中发生明显的NF-κB核转位,同时Bcl-2蛋白表达量显著增加(t=3.89,P<0.05)。采用NF-κB的特异性抑制剂Bay11-7082处理后,NF-κB蛋白的核转位明显减少,同时Bcl-2蛋白表达量显著下降(t=3.13,P<0.05)。结论:BARF1基因通过激活NF-κB信号通路上调鼻咽癌细胞中bcl-2基因的表达。

EB病毒BARF1基因对人胃上皮细胞恶性转化的作用

目的探讨EB病毒编码BARF1基因在人胃上皮细胞恶性转化中的作用。方法用携带BARF1基因的真核载体PIRES2-EGFP/BARF1,转染人胃上皮细胞系GES-1,通过G418筛选,获得稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株。GES-1细胞被分为4组,包括1个转染BARF1基因的细胞组,1个转染BARF1基因并有TPA刺激细胞组,1个转染空载体细胞组和未转染的细胞组。观察软琼脂克隆形成能力和SCID鼠体内成瘤能力。SCID鼠被分成不同的组进行皮下接种,每一组接种3只。结果转染BARF1基因的细胞组及其TPA刺激组在软琼脂中能形成克隆,转染组克隆形成率为24.2%(58/240),TPA组克隆形成率为40.0%(96/240);而未转染组和转染空载体组细胞在软琼脂中没有克隆形成。转染BARF1基因的TPA刺激组细胞在SCID鼠体内能形成了肿瘤;未转染组、转染空载体组及转染BARF1基因的细胞组在SCID鼠体内没能形成肿瘤,但转染BARF1基因的细胞组在SCID鼠体内产生了结节。结论作为EBV的一个癌基因BARF1能够使细胞发生恶性转化,获得肿瘤细胞生长的特性,在人胃上皮细胞恶性转化过程中起重要作用。

EB病毒基因BARF1在鼻咽癌中的表达及其意义

目的 EB病毒与鼻咽癌 (特别是低分化鳞癌 )密切相关。BARF1基因是EBV裂解期中的早期基因 ,本研究通过检测BARF1基因在鼻咽癌组织中的表达 ,希望能进一步揭示EB病毒与鼻咽癌的关系及致癌的可能机制。方法 对经病理确诊的 4 7例鼻咽低分化鳞癌病人分别取癌组织、癌旁组织及相对正常鼻咽黏膜和 13例其他头颈部恶性肿瘤癌组织及 8例正常人鼻咽黏膜组织 (均证实有EB病毒潜伏感染 ) ,采用巢式 -PCR技术检测BARF1在这些组织中的表达情况。结果 鼻咽癌组织BARF1基因表达率为 91.5 % (43/ 4 7) ,其中 39例相对强表达 ,4例弱表达 ;癌旁组织BARF1基因表达率为 4 6 .8% (2 2 / 4 7) ,其中 11例相对强表达 ,11例弱表达 ;相对正常黏膜BARF1基因表达率为 6 .4 % (3/ 4 7) ,3例均为弱表达 ;携带EB病毒的其他头颈部恶性肿瘤组织、正常人鼻咽黏膜组织均未检测到BARF1基因表达。结论 从相对正常鼻咽黏膜到癌旁组织再到鼻咽癌组织BARF1基因的表达趋势为从不表达到表达 ,从弱表达到强表达。说明EB病毒与鼻咽癌的发生确实存在密切相关性 ;提示启动BARF1基因的表达有可能是EB病毒致鼻咽癌的重要条件之一。

EB病毒基因BARF1在鼻咽癌细胞中的表达及意义

目的 :探讨EB (Epstein Barr)病毒新基因BARF1(BamHIArightwardopenreadingframe 1)在人鼻咽癌组织中的表达及意义 ,为深入阐明EB病毒致癌机制提供实验依据。方法 :提取RNA后 ,采用RT PCR方法扩增标本中的EBNA1(EBvirusassociatednuclearantigen 1)和BARF1mRNA ,PCR产物经 2 %琼脂糖凝胶电泳观察并照相。结果 :11例RNA合格的标本均表达EBNA1,提示病例均为EB病毒阳性病例 ;其中 9例表达BARF1,占 82 % ;而且 9例中的 7例为强阳性。结论 :EB病毒新基因BARF1mRNA在鼻咽癌细胞中高表达 ,这提示除了已经明确的潜伏性膜蛋白 1(LMP1)以外 ,BARF1可能在鼻咽癌细胞恶性增殖中发挥重要作用 。

BARF1基因的启动子活性及其在鼻咽癌细胞中肿瘤特异性分析研究

目的探讨BARF1基因的启动子活性及其在鼻咽癌细胞中是否具有肿瘤相对特异性。方法结合启动子预测软件结果(TRANSFAC和MATINSPECTOR)及引物设计软件(Primer premier 5.0),设计BARF1基因的启动子序列,验证其启动子活性,并比较该启动子在NP69细胞和CNE-2细胞中的的启动子活性的差异,验证其肿瘤相对特异性。结果测序和酶切结果证明所设计的BARF1基因的启动子的序列完全正确,其在CNE-2细胞中具有启动子活性,而在NP69细胞中不具备启动子活性,且该启动子在CNE-2细胞中的启动子活性远高于NP69细胞,差异有统计学意义(<0.05)。结论本研究设计的BARF1基因的启动子具有启动子活性,且该启动子具有肿瘤相对特异性。

携带BARF1基因的人胃上皮细胞株的建立

目的建立携带BARF1基因的人胃上皮细胞株,为探讨EB病毒编码BARF1基因对胃上皮细胞的影响而建立体外模型。方法构建携带BARF1基因的真核载体pcDNA3.1(+)-his/BARF1,转染人胃上皮细胞系GES-1,G418筛选单克隆。用CCK-8检测未转染的GES-1、转染空载体GES-1及转染BARF1基因的GES-1增殖状况。结果双酶切鉴定,666bp的BARF1基因片段已连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-his。转染细胞通过G418筛选,获得了稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株,转染BARF1基因的GES-1细胞增殖速度显著高于未转染的GES-1和转染空载体GES-1细胞(P<0.01)。结论建立了稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株。

EB病毒中早期表达的癌基因——BARF1

BARFI是近期发现EB病毒编码的早期癌基因。对其认识还处于起步阶段,本文从BARFI的基因结构、体外对细胞的转化、肿瘤细胞中的表达及可能的作用机制方面的研究做一介绍。

BARF1基因真核表达载体PIRES2-EGFP/BARF1的构建及鉴定

提取B95-8细胞RNA,进行逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增BARF1基因,将其克隆到pUM-T载体,转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和BamHI双酶切,电泳回收BARF1片段.同时用EcoRI和BamHI双酶切真核载体PIRES2-EGFP,电泳后回收载体PIRES2-EGFP并与BARF1片段连接;转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆.提取质粒并用EcoRI和BamHI双酶切鉴定插入方向,并进行测序分析.转染胃上皮细胞GES-1后,观察细胞形态与行为变化.得到666 bp的BARF1基因片段.经双酶切鉴定,BARF1基因已正确连接到PIRES2-EGFP真核表达载体;测序结果与B95-8细胞株序列完全一致.BARF1基因转染GES-1细胞后,细胞由梭形圆化,黏着力减弱,重叠生长.结果表明成功地构建了携带EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码BARF1基因的真核表达载体.

Epstein-Barr病毒基因组编码的BARF-1和EC-LF4蛋白质与免疫球蛋白结构同源

将EB病毒蛋白质BARF-1和EC-LF4与NBRF蛋白质库的序列进行局部同源性检索以及与已知的Ig V或C功能区相关分子进行对准比较,检查了同源性积分的统计学意义,并进行了二级结构预测和疏水性分析,确定了BARF-1的第13-124位和第126-221位残基片段分别与V和C样功能区类似,EC-LF4的第20-135位残基片段与V样功能区相似,BARF-1是非膜蛋白,EC-LF4是膜整合蛋白,其胞外部分近膜侧有一个类似于Ig绞链区的序列。因此,BARF-1与Ig轻链结构相似,EC-LF4与CD8抗原的第一条链相似。根据Ig超族分子的一般功能(即介导细胞粘附和细胞识别),推测EC-LF4可能作为一种粘附分子与淋巴细胞表面的Ig相关分子结合而促进EB病毒对淋巴细胞的感染。BARF-1因已知与病毒复制有关,与Ig超族的一般功能无关。EC-LF4和BARF-1的Ig样功能区可能来源于EB病毒对宿主细胞Ig基因的整合。

BARF1基因转染对人胃上皮细胞Bcl-2表达的影响

①目的探讨EB病毒编码BARF1基因对人胃上皮细胞Bcl-2表达的影响。②方法用携带BARF1基因的真核载体PIRES2-EGFP/BARF1,转染人胃上皮细胞系GES-1,G418筛选单克隆。用免疫组化法检测转染细胞及未转染细胞Bcl-2的表达状况。③结果获得稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株,转染BARF1基因的细胞Bcl-2表达显著高于未转染和转染空载体GES-1细胞(P<0.01)。④结论 BARF1基因可能上调了人胃上皮细胞Bcl-2表达。

鼻咽癌和健康人群中EB病毒BARF0基因序列分析

目的了解山东地区鼻咽癌(NPC)及健康人群中EB病毒(EBV)编码BARF0基因变异特征,探讨其变异意义。方法采用PCR和DNA测序检测NPC组织以及健康成年人咽漱液标本中EBV的BARF0基因序列,与EBV标准株进行比较,根据特征性突变对变异进行分类。结果 73例NPC病人和70例健康人群BARF0成功测序,共检出4处共有突变。其中36例(49.3%)NPC和29例(41.4%)健康人群同时出现4处共有突变(T160473G、T160545C、A160701C和C160707G),被分类为4M变异型;35例(48.0%)NPC和38例(54.3%)健康人群同时出现除T160473G外的3处共有突变,被分类为3M变异型,其余2例(2.7%)NPC和3例(4.3%)健康人群分类为Others。χ2检验精确概率法分析表明,BARF0变异型在2种人群中的分布差异无统计学意义(P=0.618)。结论山东地区NPC和健康人群中EBV毒株BARF0序列变异一致,BARF0基因变异的地域性分布及与EBV相关肿瘤的关系值得进一步研究。

EB病毒BARF1基因真核表达载体的构建

①目的构建携带EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码BARF1基因的真核表达载体。②方法根据GenBan提供的BARF1基因的cDNA序列,设计特异性引物,并在两端添加酶切位点;常规培养B95-8细胞,提取细胞RNA,通过RT-PCR扩增BARF1基因,将其克隆到pUM-T载体,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切与测序鉴定,证实BARF1基因已克隆到pUM-T载体。凝胶回收双酶切产物BARF1片段,再将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-his,转化E.coli DH5α,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切分析,确认插入方向。③结果以B95-8细胞提取RNA进行RT-PCR扩增的cDNA为模板扩增BARF1,得到与预期片段大小相符的666bp的片段;对所提质粒进行鉴定后,证实目的基因BARF1片段已插入pUM-T载体,经双酶切和测序分析,确认BARF1基因已正确连接到pcDNA3.1(+)-his真核表达载体。④结论成功地构建真核表达载体。pcDNA3.1(+)/BARF1-his。

EB病毒编码的BARF1对GES-1细胞的影响

目的探讨爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码的BARF1基因对人胃上皮细胞(GES-1)增殖、迁移及细胞周期分布的影响。方法将pIRES-EGFP/BARF1重组质粒、pIRES-EGFP空载体转染GES-1细胞,通过G418筛选,获得稳定表达pIRES-EGFP/BARF1及pIRES-EGFP的GES-1细胞。在荧光显微镜下观察转染与未转染组细胞生长状况;通过逆转录PCR(Reverse Transcription-PCR,RT-PCR)检测转染细胞中BARF1基因表达情况;通过细胞计数及CCK8法评估转染与未转染三组细胞的增殖能力;通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色法评价不同组别细胞周期蛋白Cyclin D1的表达情况;应用划痕实验分别对稳定转染BARF1组和空载体组GES-1细胞的迁移效率进行分析评价;应用流式细胞仪检测与分析细胞周期的分布情况。结果获得稳定表达pIRES-EGFP/BARF1、pIRES-EGFP的GES-1细胞模型;稳定转染BARF1组的细胞增殖能力高于未转染组及转染空载体组,并且稳定转染BARF1组S期显著延长;稳定转染BARF1组GES-1细胞的迁移能力比转染pIRES-EGFP空载体组得到明显提升;细胞周期蛋白Cyclin D1集中表达在稳定转染BARF1组的GES-1细胞核内。结论作为EBV编码的癌基因BARF1能够促进人胃上皮细胞GES-1增殖、迁移及分裂,抑制细胞凋亡,促进胃上皮细胞的恶性转化。

EB病毒LMP-1、BALF_4及BARF_1片段的B细胞表位预测

目的:预测EB病毒LMP-1、BALF4及BARF1片段的B细胞表位。方法:采用Protean软件分析EBV的LMP1、BALF4及BARF1三个氨基酸片段的亲水性、表面可能性、抗原指数及其二级结构中的柔性区域,并结合吴玉章的抗原指数预测法预测其B细胞表位。结果:B细胞表位可能位于LMP-1 N端第356-358,2-19,249-314区段,BARF1N端第8-11,18-25,41-49,203-211区段,BALF4N端第385-387,833-845,398-415,427-435,453-458,23-32,466-473,234-250,642-652区段;另外LMP-1第185-223、BARF1第265-272,132-135以及BALF4第827-832区段内或附近也可能存在B细胞表位。结论:用多参数同时预测LMP-1、BALF4及BARF1的B细胞表位,为制备高效的鼻咽癌血清学诊断试剂和表位疫苗奠定了理论基础。

EB病毒BARF1蛋白诱导胃癌细胞c-met和Bcl-2基因过表达

目的探讨EB病毒BARF1蛋白对胃癌细胞增殖与凋亡的影响。方法以空载体转染细胞SGC-pSG5为对照,采用细胞计数法和流式细胞术检测BARF1表达胃癌细胞系SGC7901(SGC-BARF1)的增殖能力。采用细胞计数法和Hoechst染色法分析紫杉醇诱导后的细胞凋亡状况。以实时荧光定量PCR和免疫印迹法分析细胞中c-met和Bcl-2基因表达的变化。结果与对照相比,BARF1表达细胞的增殖速度加快(P<0.05),处于细胞周期S期的细胞比例增高(P<0.01),抵抗紫杉醇诱导凋亡的能力明显增强(P<0.05),c-met和Bcl-2基因mRNA和蛋白质的表达量均显著增加,且二者呈正相关(P<0.01)。结论BARF1蛋白可能通过上调胃上皮细胞c-met和Bcl-2基因表达促进胃上皮细胞的增殖和抑制其凋亡,从而促进细胞的恶性转化。

EB病毒编码的蛋白质在癌变过程中的作用

EB病毒是一种与人类肿瘤有密切关系的DNA病毒。在病毒感染的不同时期有不同病毒编码蛋白质的表达,因此研究所表达不同抗原的致癌作用将有助于研究EB病毒的致瘤机制。本文仅就EB病毒编码蛋白LMP1、EBNA1、EBNA2、BARF0和BARF1在癌变中作用的研究进展作一综述。