Bay41-4109对大鼠肝脏P450酶系诱导作用的研究

目的:观察Bay41-4109(2-heteroaryl-dihydropyrimidines,HAP,异芳基二氢嘧啶类化合物)诱导处理对大鼠肝细胞色素P450(CYP450)及其主要亚型的影响,并探讨其可能的机制。方法:雄性Wistar大鼠分别用Bay41- 4109 7.5,30和120 mg·kg^(-1)·d^(-1)连续灌胃诱导处理5 d,测定肝脏脏器系数、微粒体总CYP450含量和CYP1A2,2B1/2和3A4亚型活性,并以苯巴比妥为对照。结果:经Bay41-4109三个不同剂量诱导后,大鼠肝脏脏器系数、总P450含量、CYP1A2,281/2和3A4活性与对照相比均有不同程度升高,并有明确的剂量效应关系,其诱导CYP450代谢酶谱的改变与苯巴比妥基本一致;且Bay41-4109在7.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)时即对CYP2B1/2和CYP1A2有非常显著的诱导作用,120 mg·kg^(-1)·d^(-1)时引起此两种亚型活性变化大致与苯巴比妥60 mg·kg^(-1)·d^(-1)相当。结论:Bay41-4109属于苯巴比妥类的肝药酶强诱导剂,可能通过药物代谢酶系统影响其他药物的代谢。

基因芯片技术研究抗病毒药物Bay41-4109的肝毒性机制

背景与目的:研究新型抗乙肝病毒药物Bay41-4109的肝毒性机制。材料与方法:用典型诱导剂苯巴比妥作为对照,观察大鼠连续5d灌胃给予Bay41-4109后肝脏脏器系数的变化,并对肝脏进行组织学检查;用MTT比色法进行HepG2细胞毒性实验。然后利用大鼠和人的全基因组芯片,分析Bay41-4109对大鼠肝脏和人肝细胞基因表达谱的影响,并对基因芯片数据进行聚类分析和初步功能分析,采用RT-PCR对部分差异表达的基因进行验证。结果:Bay41-4109和苯巴比妥均引起大鼠肝脏脏器系数显著增高(P<0.05),肝组织局部出现小的灶性坏死;Bay41-4109引起大鼠肝脏发生差异表达的基因主要与药物代谢及脂肪和能量代谢有关,其中有26个基因的改变与苯巴比妥一致。体外研究发现Bay41-4109在IC20和IC50浓度下引起HepG2细胞发生差异表达的基因主要与脂肪、氨基酸、能量代谢有关,与大鼠肝脏基因芯片结果一致。差异表达基因用RT-PCR能得到验证。结论:Bay41-4109的肝毒性与药物代谢酶表达异常以及脂肪能量代谢异常有关。

抗乙肝病毒新药Bay41-4109的发现毒理学研究

目的:利用发现毒理学中的临床前先导化合物优化技术(preclinical lead optimization technolo- gies,PLOTs)对抗乙肝病毒候选新药Bay41-4109的一般毒性、遗传毒性和生殖毒性进行研究,为早期发现候选新药的毒性提供实验依据。方法:一般毒性研究中分别以MTT比色法和上下法检测Bay41-4109的体外细胞毒性和小鼠LD_(50);遗传毒性研究中分别以Ames波动试验、SOS显色试验、双核细胞微核试验检测Bay41-4109诱发鼠伤寒沙门菌基因回复突变的能力、诱发大肠杆菌的原发DNA损伤效应以及对CHL细胞的染色体断裂效应;生殖毒性研究中以大鼠胚胎中脑细胞微团培养试验来检测Bay41-4109的致畸性。结果:Bay41-4109对CHL细胞的IC_(50)为54.0μmol·L^(-1),对雌性小鼠的LD_(50)大于2 000 mg·kg^(-1)。无论有无S9活化,Bay41-4109均不引起沙门菌回复突变,也不导致DNA损伤和染色体断裂。Bay41-4109对大鼠胚胎中脑细胞亦无致畸作用。结论:早期毒性筛选结果表明:Bay41-4109未表现明显的遗传毒性和生殖毒性。

Bay41-4109抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的观察Bay41-4109对2.2.15细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）和乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）DNA的影响,探讨Bay41-4109的体外抗HBV作用。方法将一定浓度的Bay41-4109加入培养的2.2.15细胞,通过四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法观察药物对细胞的毒性作用;应用酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）及实时荧光定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）分别检测药物对细胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV DNA的影响。结果 Bay41-4109在12.5~50μM的浓度范围内,对2.2.15细胞的毒性作用逐渐增加,TC50为35.43μM;酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）结果显示,Bay41-4109对2.2.15细胞分泌HBeAg有明显的抑制作用并有一定的剂量依赖关系,其IC50为8.22μM;荧光定量PCR法结果分析显示Bay41-4109能使2.2.15细胞上清HBV DNA的含量明显下降。结论 Bay41-4109对2.2.15细胞分泌HBeAg和HBV DNA有一定的抑制作用。

BAY41-4109对乙肝病毒衣壳组装的影响

乙肝病毒衣壳蛋白成功组装成衣壳二十面体的过程是病毒前基因组RNA逆转录形成成熟DNA的必要步骤。衣壳结构的轻微改变或破坏能对病毒子代传播产生巨大影响。应用透射电子显微镜研究发现小分子抗病毒化合物(heteroaryldihydropyrimidine,HAP)BAY41-4109在与衣壳蛋白二聚体摩尔浓度比达到1∶2时,能干扰乙肝病毒衣壳蛋白组装成衣壳二十面体。在BAY41-4109的作用下,衣壳蛋白发生错误组装,形成不规则球体、平面片状结构和管状结构。应用图像处理技术对管状结构进行分析,发现它是衣壳蛋白重新装配形成的具有螺旋对称性的规则组装体,衣壳蛋白按六角晶格方式排列,其最小组成单位是衣壳蛋白的二聚体。

BAY 41-2272防治大鼠Thy-1肾炎的实验研究

目的:观察比较BAY41-2272和己酮可可碱(PTX)这两种增强环磷酸鸟苷(cGMP)活性的物质对大鼠Thy-1诱导的进展性肾病模型的疗效,探讨肾纤维化治疗的新途径。方法:成功诱导Thy-1肾炎后,将大鼠分为四组:即肾纤维化组(RF组)、BAY 41-2272治疗组、PTX治疗组和对照组。治疗15周后,分别检测各组大鼠血清肌酐和尿蛋白排泄量,肾组织病理和免疫组化方法检测肾小球/小管间质基质堆积程度和ED1/PCNA阳性细胞数,检测肾小球和皮质转化生长因子TGF-β1、纤粘蛋白(fi- bronectin)、基质金属蛋白酶抑制物(TIMP-1)等蛋白能表达水平,ELISA方法检测肾小球/小管间质细胞的基础、刺激后cGMP水平。RT-PCR方法检测内皮细胞一氧化氮合成酶、α1/β1可溶性鸟苷酸环化酶mRNA水平。结果:观察结束时,BAY41-2272显著降低大鼠尿蛋白排泄和血肌酐水平,显著减轻肾小球/小管间质基质堆积程度,降低巨噬细胞浸润数目和TGF-β1、fibronectin表达水平,而PTX治疗仅产生轻微的变化。肾纤维化组大鼠的小管间质sGC mRNA、NO刺激的cGMP水平显著高于对照组,而肾小球的则较对照组降低;BAY41-2272治疗后肾小球/小管间质sGC mRNA、刺激后cGMP水平可显著提高,而PTX治疗的只有轻度提高而无统计学意义。结论:BAY41-2272治疗可显著改善肾组织NO-cGMP信号通路转导和cGMP的活性,可有效的延缓肾纤维化的进展,而PTX疗效则相对很弱。采用BAY41-2272提高cGMP活性的方案可能为肾纤维化提供新颖、极具前景的治疗策略。

NO-sGC-cGMP信号通路通过cGK调控PAI-2基因表达

目的:体外分析环磷酸鸟苷是否(cGMP)通过cGMP依赖性蛋白激酶(cGK)调控人纤溶酶原激活物抑制剂2(PAI-2)基因启动子活性,阐明PAI-2基因表达的分子调控机制。方法:构建cGK的真核过表达载体及其小干扰RNA(siRNA)敲减体系,以及PAI-2基因启动子缺失突变序列双萤光素酶报告载体,瞬时转染人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs),在可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)特异性刺激剂BAY 41-2272处理前后,real-time PCR检测PKG1(cGK编码基因)和PAI-2基因的mRNA水平。结果:cGK过表达能显著上调细胞内PKG1的mRNA水平和蛋白表达水平,cGK siRNA则能显著降低其表达(P<0.01);BAY 41-2272处理HPASMCs后,PKG1基因和PAI-2基因的mRNA水平均明显升高,而cGK siRNA则能抑制该上调作用(P<0.01);双萤光素酶报告基因实验显示,cGK过表达显著上调PAI-2基因启动子活性,而cGK敲减组其活性与对照组比较差异无统计学显著性;BAY 41-2272处理后PAI-2基因启动子缺失突变体PAI-2-Prom-M1组和PAI-2-Prom-M2组的萤光素酶相对活性显著增强,其它启动子缺失突变体组其活性与对照组比较差异无统计学显著性。结论:NO-sGC-cGMP信号通路通过cGK调控PAI-2表达,PAI-2基因转录起始位点5’侧翼区的-1 000 bp^-800 bp是其表达调控的关键区域之一。

乙型肝炎病毒核心蛋白在HepG2．2．15细胞中的亚细胞定位及转移

目的观察HepG2．2．15细胞内HBV核心蛋白的亚细胞定位及转移，了解核心蛋白的入核机制。方法2％二甲亚砜或（和）1μmol／LBay414109处理HepG2．2．15细胞4d；荧光共聚焦显微镜观察HBsAg和HBcAg在细胞内的定位；Westernblot检测胞质和胞核中的HBcAg水平；选择性PCR检测胞核内HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）水平。结果二甲亚砜处理提高了胞质和胞核内的HBcAg表达及核内的cccDNA水平；Bay414109处理后胞质中HBcAg水平下降但胞核中HBcAg水平上升，cccDNA水平下降；联合应用二甲亚砜和Bay41—4109处理后HBsAg在胞质内呈条索状分布，胞质中HBcAg水平下降，但胞核内HBcAg明显上升，cccDNA水平下降。结论HepG2．2．15细胞中存在HBV核心颗粒入核障碍，游离核心蛋白易于通过核孔，二甲亚砜可促进核心蛋白进入细胞核，并有助于cccDNA的形成。

化学发光Southern blot法检测HBV体外复制及其应用于药物对HBV的抑制分析

目的:建立化学发光Southern blot检测细胞内HBVDNA的方法,同时检测3种不同靶点抗乙肝药物的体外作用。方法:用地高辛标记HBV探针,优化杂交条件,检测来自HepG2及HepG2.2.15 HBV DNA复制中间体;利用建立的化学发光Southern blot检测HBV DNA的方法检测经拉米夫定、Bay41-4109、α-Galcer以不同药物浓度处理的HepG2.2.15HBV DNA复制中间体的水平。结果:(1)标记的HBV探针的检测灵敏度为0.1pg,杂交系统的检测灵敏度为1pg,可检测到HepG2.2.15细胞内的HBV DNA特异性信号;(2)以该法检测胞内HBV DNA可见3种药物都有明显的抑制作用,其半数有效量(IC50)分别为1.53μmol/L、0.41μmol/L、0.01μmol/L。结论:胞质HBVDNA的水平能准确地反映不同靶点抗HBV药物的抗病毒效果,建议在观察药物特别是中药抗病毒研究中采用。