加工番茄上CMV与BBWV的ELISA检测及相关性分析

[目的]探讨加工番茄上2种病毒的侵染方式及其积累量的相关性。[方法]以黄瓜花叶病毒(CMV)和蚕豆萎蔫病毒(BBWV)为研究对象,用针对CMV和BBWV的单克隆抗体对田间表现病毒病症状的115个加工番茄自然病株进行间接ELISA检测,通过复合侵染病株上2种病毒的积累量分析两者之间的相关性。[结果]CMV和BBWV在加工番茄上的侵染率分别为73.0%和59.1%,并且2种病毒常复合侵染,复合侵染率达53.9%。BBWV单独侵染率很低,其侵染方式主要是与CMV复合侵染。CMV和BBWV在病株上的带毒量分析结果表明,2种病毒在病株上的积累是相互影响的,为正相关关系。[结论]该研究为病毒互作机制研究提供了理论基础。

侵染加工番茄的BBWV2的分子鉴定及田间检测

利用蚕豆病毒属的兼并引物对23个加工番茄病株进行RT-PCR检测,其中19株检测出被该属病毒侵染。从中选取4个病株的RT-PCR产物进行克隆和测序,将所得序列经过基因库检索发现,4个序列均与蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)基因组RNA1的序列同源性最高。然后对病毒分离物XJ14-1基因组进行进一步的克隆和测序,获得RNA1组分3659个核苷酸,RNA2组分1300个核苷酸,序列比对结果显示,它们与BBWV2的RNA1和RNA2具有高的序列同源性,分别为76.6%~94%和76.9%~94.1%,而与BBWV1的RNA1和RNA2的序列相似性都很低。因此分子鉴定结果表明,新疆加工番茄受到BBWV2的侵染。利用BBWV2的单克隆抗体对田间不同品种(品系)加工番茄病株进行ELISA检测,结果显示田间病株带毒率达到53.3%,并且供试20品种(品系)均可被BBWV2侵染,该数据表明,BBWV2在田间发生普遍。

与BBWV 2胞间运动和长距离转运相关的寄主细胞超微结构研究

植物病毒侵入寄主后在细胞中复制增殖,通过胞间连丝短距离胞间运动和维管束长距离转运到达植株各个部位,形成系统性侵染。以烟草花叶病毒(TMV)为代表的运动蛋白MP/RNA结合体形式和以豇豆花叶病毒(CPMV)为代表的管状结构形式是2种最主要的胞间运动形式。有关蚕豆萎焉病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBMV 2)所在蚕豆病毒属(Fabavirus)的胞间运动机理迄今尚不明了。对BBWV 2中国分离物B935侵染的豌豆和蚕豆进行了详细的超微结构观察,得到了一些涉及病毒胞间运动和长距离转运的超微结构证据。

太子参BBWV2和TuMV的巢式RT-PCR检测

为探求快速、灵敏的太子参脱毒检测技术,建立太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)和芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的巢式RT-PCR快速检测方法,根据GenBank数据库中这2种病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因核苷酸序列的保守区域分别设计2对简并引物,建立和优化巢式RT-PCR扩增体系,继而进行常规RT-PCR和巢式RT-PCR灵敏度的比较,并应用巢式RT-PCR对7份田间栽培太子参病样和4份脱毒苗样品进行检测。结果显示:BBWV2、TuMV的巢式引物最佳退火温度分别为60、62℃;采用巢式RT-PCR,这两种病毒样品cDNA原液在稀释10~5倍后仍能扩增出特异性条带,比常规RT-PCR的灵敏度至少高10倍。本研究建立的巢式RT-PCR检测方法可快速、稳定、准确地检测BBWV2和TuMV,且具有更高的灵敏度,更能满足太子参脱毒检测的需要。

蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV2)基因组RNA_2的序列测定

以表现顶枯症状的11个辣椒病株的dsRNA为模板,用蚕豆病毒属(Fabavirus)的兼并引物Fab5_R1F和Fab5_R1R进行PCR扩增,其中10个病株扩增到长约400 bp的预期大小的片段,选取其中代表病株XJP1-1的PCR产物进行克隆、测序,得到389 nts的序列片段。基因库检索表明,该片段为蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV2)基因组RNA1的片段。说明经PCR检测,具有400 bp片段的10个田间病株均有BBWV2侵染。将基因库中已登陆的BBWV2的RNA2核苷酸序列进行序列比对,然后根据RNA2的序列保守区设计引物R2F-1F和R2F-1R。以病株的总RNA为模板,对分离物XJP1-1进行RNA2组分的克隆、测序,获得1 302 nts的RNA2序列,序列比较显示,该序列与新疆侵染加工番茄的分离物XJ14-1具有最高的序列同源性,为88.9%。

蚕豆萎蔫病毒2的分子鉴定及RNA1组分5′末端核苷酸序列分析

用蚕豆病毒属(Fabavirus)的兼并引物Fab5′R1F和Fab5R′1R对自然感病的4株加工番茄、1株辣椒和2株一串红病株进行RT-PCR,将扩增到的长约400bp的片段进行克隆和测序。结果发现:来自7个病株的9个病毒分离物均为蚕豆萎蔫病毒2(BBWV-2)基因组RNA1组分5′末端的353～392个核苷酸;同源性比较表明,9个序列之间的同源性为90.4%～99.2%,与已报道的BBWV2的同源性为89.5%～95.9%。序列比对发现,BBWV2基因组RNA1组分5′末端非编码区包含了由11个碱基(AAACAGCUUUC)组成的重复序列,而分别来自加工番茄分离物XJ14-1b和一串红的分离物S12在重复序列区段内比其它所有分离物缺少了包括2个重复序列在内的36个碱基。

蚕豆萎蔫病毒中国分离物RNA2全序列及多聚蛋白切割位点

对蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)分离物B935 RNA2全序列进行了测定,全长由3601个核苷酸组成(不包括3′端Poly(A))。RNA2包含一个长的开读框,该开读框起始于231位,终止于3428位,编码一个分子量为119 ku的多聚蛋白。对外壳蛋白亚基N端氨基酸序列测定表明外壳蛋白大亚基(LCP)和小亚基(SCP)是由119 ku多聚蛋白中谷酰胺与甘氨酸及谷酰胺与丙氨酸之间的切割产生的,LCP含有402个氨基酸,SCP含有197个氨基酸。与蚕豆病毒属(Fabavirus)病毒基因组核苷酸及编码的蛋白质氨基酸序列比较表明,B935与BBWV2分离物及广藿香轻花叶病毒具有很高的同源性,而与BBWV1分离物的同源性较低。B935与豇豆花叶病毒属(Comovirus)和线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的基因组结构相似,但序列同源性很低。B935与豇豆病毒属病毒的LCP和SCP氨基酸具有共同的保守序列。用4株单克隆抗体进行TAS-ELISA测定表明B935与BBWV1分离物(NRS和PH3)抗原上有差异。

蚕豆萎蔫病毒ELISA检测系统建立及其应用

从制备的蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）抗血清中提纯ＩｇＧ，并用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记，建立了ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测ＢＢＷＶ的方法。ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测时包被ＩｇＧ以２６．９μｇ／ｍｌ效果最好，ＨＲＰ－ＩｇＧ结合物以１８００～１１６００效果最佳。ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测ＢＢＷＶ病叶粗汁液的最大稀释度为１３２０，检测提纯病毒的最低浓度为０．７４４μｇ／ｍｌ。田间病样测定表明，ＢＢＷＶ在蚕豆、豌豆、豇豆、大豆、茄子和辣椒等作物上发生很普遍，在菜豆上也有零星发生，而在莴苣、芹菜、白菜、萝卜、花椰菜上未测到ＢＢＷＶ。ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测结果与生物学检测结果基本相符，符合率达９７．６％。

复合侵染的蚕豆黄花叶病病原诊断

应用透射电镜、ELISA和RT-PCR技术对浙江丽水的蚕豆黄化花叶病株进行了病原诊断,电镜负染色发现病株汁液中存在线状和球状两种病毒粒子,线状粒子长度在600nm^800nm的占73%,球状粒子直径约26nm;超薄切片观察到细胞质中存在Ⅱ型风轮状内含体及大量电子致密无定型体,还有线粒体增生聚集和膜结构的增生,两类细胞病变现象出现在相邻细胞中;用BBWV 2的单克隆抗体对病汁液ELISA检测结果为阳性反应;用Potyvirus通用引物进行RT-PCR检测有1.7kb特异性扩增片段产生。根据以上结果诊断病原为蚕豆萎焉病毒2(BBWV 2)和菜豆黄花叶病毒(BYMV),二者为复合侵染。

石河子地区加工番茄坏死条斑病毒原的ELISA检测及品种抗病性鉴定

用番茄花叶病毒、蚕豆萎蔫病毒和黄瓜花叶病毒的单克隆抗体对田间表现坏死条斑症状的315个加工番茄自然病株进行了ELISA检测。结果表明,这3种病毒的检测侵染率很高,分别为69.3%、66.7%和75.1%,但其单一病毒的侵染率却很低,仅分别为1.5%、2.4%和8.5%。表明这3种病毒是石河子地区加工番茄上的主要病毒种类,其复合侵染极可能是造成田间大量病株呈现严重坏死条斑症状的主要因素。并且对田间自然发病的21个加工番茄品种的上述3种病毒带毒情况进行了ELISA检测,虽然供试品种体内带毒量都较高,但品种之间却表现出一定的抗病性差异。

菠菜矮花叶病的研究

1981年5月京郊菠菜留种地发生菠菜矮花叶病。染病植株呈现畸形花叶,严重矮缩,影响抽薹结籽。通过病毒寄主范围的测定证明,它可侵染豆科、茄科、藜科、十字花科中的19种植物。可由桃蚜进行非持久性传毒。从提纯病毒的分析超离心得到三个沉降值,分别为57s、94s和113s。在电镜下观察到球形病毒颗粒,直径为24～25毫微米。根据现有资料分析,引起菠菜矮花叶病的病毒系为蚕豆萎蔫病毒的一个株系。

太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重RT-PCR检测

针对不同产地栽培的太子参(Pseudostellaria heterophylla)中主要存在芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)和蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)侵染且为害严重的情况,建立能同时检测这2种病毒的双重RT-PCR快速检测方法。根据Gen Bank数据库中的Tu MV、BBWV外壳蛋白(coat protein,CP)基因核苷酸序列的保守区域分别设计简并引物,在单一RT-PCR检测体系的基础上,建立和优化双重RT-PCR检测体系。双重RT-PCR的优化结果显示,最佳扩增循环数为35,最佳引物浓度为0.4μmol·L^(-1),最佳退火温度为51℃。其灵敏度测定结果显示,2种病毒在样品c DNA稀释至原液的10-4倍后仍能扩增出特异条带。应用该方法对7份栽培太子参样品和4份脱毒苗样品进行了检测,结果表明,建立的双重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏地同时检测Tu MV和BBWV。