侵染加工番茄的BBWV2的分子鉴定及田间检测

利用蚕豆病毒属的兼并引物对23个加工番茄病株进行RT-PCR检测,其中19株检测出被该属病毒侵染。从中选取4个病株的RT-PCR产物进行克隆和测序,将所得序列经过基因库检索发现,4个序列均与蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)基因组RNA1的序列同源性最高。然后对病毒分离物XJ14-1基因组进行进一步的克隆和测序,获得RNA1组分3659个核苷酸,RNA2组分1300个核苷酸,序列比对结果显示,它们与BBWV2的RNA1和RNA2具有高的序列同源性,分别为76.6%~94%和76.9%~94.1%,而与BBWV1的RNA1和RNA2的序列相似性都很低。因此分子鉴定结果表明,新疆加工番茄受到BBWV2的侵染。利用BBWV2的单克隆抗体对田间不同品种(品系)加工番茄病株进行ELISA检测,结果显示田间病株带毒率达到53.3%,并且供试20品种(品系)均可被BBWV2侵染,该数据表明,BBWV2在田间发生普遍。

太子参BBWV2和TuMV的巢式RT-PCR检测

为探求快速、灵敏的太子参脱毒检测技术,建立太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)和芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的巢式RT-PCR快速检测方法,根据GenBank数据库中这2种病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因核苷酸序列的保守区域分别设计2对简并引物,建立和优化巢式RT-PCR扩增体系,继而进行常规RT-PCR和巢式RT-PCR灵敏度的比较,并应用巢式RT-PCR对7份田间栽培太子参病样和4份脱毒苗样品进行检测。结果显示:BBWV2、TuMV的巢式引物最佳退火温度分别为60、62℃;采用巢式RT-PCR,这两种病毒样品cDNA原液在稀释10~5倍后仍能扩增出特异性条带,比常规RT-PCR的灵敏度至少高10倍。本研究建立的巢式RT-PCR检测方法可快速、稳定、准确地检测BBWV2和TuMV,且具有更高的灵敏度,更能满足太子参脱毒检测的需要。

蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV2)基因组RNA_2的序列测定

以表现顶枯症状的11个辣椒病株的dsRNA为模板,用蚕豆病毒属(Fabavirus)的兼并引物Fab5_R1F和Fab5_R1R进行PCR扩增,其中10个病株扩增到长约400 bp的预期大小的片段,选取其中代表病株XJP1-1的PCR产物进行克隆、测序,得到389 nts的序列片段。基因库检索表明,该片段为蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV2)基因组RNA1的片段。说明经PCR检测,具有400 bp片段的10个田间病株均有BBWV2侵染。将基因库中已登陆的BBWV2的RNA2核苷酸序列进行序列比对,然后根据RNA2的序列保守区设计引物R2F-1F和R2F-1R。以病株的总RNA为模板,对分离物XJP1-1进行RNA2组分的克隆、测序,获得1 302 nts的RNA2序列,序列比较显示,该序列与新疆侵染加工番茄的分离物XJ14-1具有最高的序列同源性,为88.9%。

蚕豆萎蔫病毒2的分子鉴定及RNA1组分5′末端核苷酸序列分析

用蚕豆病毒属(Fabavirus)的兼并引物Fab5′R1F和Fab5R′1R对自然感病的4株加工番茄、1株辣椒和2株一串红病株进行RT-PCR,将扩增到的长约400bp的片段进行克隆和测序。结果发现:来自7个病株的9个病毒分离物均为蚕豆萎蔫病毒2(BBWV-2)基因组RNA1组分5′末端的353～392个核苷酸;同源性比较表明,9个序列之间的同源性为90.4%～99.2%,与已报道的BBWV2的同源性为89.5%～95.9%。序列比对发现,BBWV2基因组RNA1组分5′末端非编码区包含了由11个碱基(AAACAGCUUUC)组成的重复序列,而分别来自加工番茄分离物XJ14-1b和一串红的分离物S12在重复序列区段内比其它所有分离物缺少了包括2个重复序列在内的36个碱基。

与BBWV 2胞间运动和长距离转运相关的寄主细胞超微结构研究

植物病毒侵入寄主后在细胞中复制增殖,通过胞间连丝短距离胞间运动和维管束长距离转运到达植株各个部位,形成系统性侵染。以烟草花叶病毒(TMV)为代表的运动蛋白MP/RNA结合体形式和以豇豆花叶病毒(CPMV)为代表的管状结构形式是2种最主要的胞间运动形式。有关蚕豆萎焉病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBMV 2)所在蚕豆病毒属(Fabavirus)的胞间运动机理迄今尚不明了。对BBWV 2中国分离物B935侵染的豌豆和蚕豆进行了详细的超微结构观察,得到了一些涉及病毒胞间运动和长距离转运的超微结构证据。

蚕豆萎蔫病毒2号板蓝根分离株全基因组序列测定与分析

板蓝根(Isatidis Radix)病毒病害的发生已对其产量和品质造成了严重影响。因此,建立一套灵敏、快速、有效的板蓝根病毒病害检测手段十分重要。本研究利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)等技术对感病板蓝根进行鉴定,确定其被蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2, BBWV2)所侵染。为明确BBWV2板蓝根分离物(BBWV2-IR)的进化关系,对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其RNA1序列全长为5 955 bp,RNA2序列全长为3 602 bp,分别编码由1 870和1 064个氨基酸组成的多聚蛋白质。序列比对发现,BBWV2-IR RNA1与BBWV2-Am分离物的同源性最高,RNA2与BBWV2-SN分离物的同源性最高。全基因组变异情况分析表明,BBWV2-IR RNA1和RNA2分别与其同源性最高的株系存在多个氨基酸变异位点。系统进化分析表明,BBWV2-IR RNA1与BBWV2-Am RNA1聚为一簇,RNA2与BBWV2-SN RNA2聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了BBWV2板蓝根分离株的全基因组序列,并明确其在进化过程中的地位和区域变化情况,为进一步研究BBWV2-IR致病性变异提供一定的理论基础。

石河子一串红花叶病病原的分子鉴定

为了防治石河子一串红花叶病,采用提取dsRNA/RNA、RT-PCR、克隆和序列分析对病原进行了检测鉴定。结果表明:从表现花叶的S4分离物中提取dsRNA,得到大小约4700和6300 bp的片段,以此dsRNA为模板,用蚕豆病毒属(Fabavirus)的兼并引物进行RT-PCR,扩增得到1条约390 bp片段特异性条带,序列测定该片段大小为391nt,blast比对分析与蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV2)的同源性最高,表明S4分离物为BBWV2。RNA1基因组全序列测定及分析结果表明,基因组大小为5957nt(不含poly A),仅编码1个开放阅读框(ORF),与已报道BBWV2的RNA1序列同源性为78.4%-100.0%。