卡介菌及其衍生制品鉴别实验用BCG DNA国家参考品的研制

目的建立BCG DNA定性用国家参考品,供BCG菌株、卡介菌多糖核酸注射液等卡介菌衍生制品鉴别实验用。方法以紫外分光法检测260nm和280nm的吸光度值,比较A260/280的比值,考量国家参考品BCG DNA的纯度指标;以多重PCR法检测BCG DNA特异性缺失区RD1区是否存在,验证所制备的BCG DNA可作为定性用国家参考品,组织3家实验室对该参考品进行验证;并在不同时间,观察其稳定性。结果所制备的BCG DNA A260/286=1.96>1.8;BCG DNA国家参考品经多重PCR扩增BCG缺失区RD1的产物为约200bp DNA片段,与卡介菌巴斯德株DNA结果相同,3家实验室的验证结果一致,该制品经37℃4周,4℃3个月、6个月、12个月放置后,PCR结果不变。结论该BCG DNA制品纯度高,稳定,可作为BCG DNA定性用国家参考品,在卡介苗相关制品的质量控制中,做为BCG菌株、卡介菌多糖核酸注射液等卡介菌衍生制品鉴别实验用的国家参考品。

卡介菌多糖核酸对干扰素的诱生和促诱生活性

报道卡介菌多糖核酸在体外诱生小鼠脾细胞产生干扰素的活性较低,但与刀豆素A合用则有明显的促诱生活性。所诱生的干扰素主要是γ干扰素。γ干扰素是抗病毒并有免疫调节功能的淋巴因子,提示卡介菌多糖核酸性剂的药理作用可能与其诱导γ干扰素有关。

不同菌种卡介苗人体免疫应答比较

我们于1983～1991年,分别用六株菌种制备的六种试制苗和全国五个生物制品研究所生产的5种成品苗,在杭州市、大连市和辽宁省3个点,对17524名新生儿接种,分别于接种后不同时间用PPD作皮肤试验进行免疫反应观察。结果表明,试制苗大连点12周的阳性率以上海株苗、巴西株苗为高,北京株苗为低;5年持续阳性率以上海株苗为最高,北京株苗为最低。在杭州点,以上海株苗和日本株苗为最高,亦以北京苗为低。成品苗杭州点和辽宁点12周的阳性率以上海所苗为最高,兰州所苗为最低。综合评议均以上海所苗为优。其淋巴结化脓仅出现在活菌数较高的制品中,发生率不超过1‰。

分泌表达ESAT-6的重组卡介苗抗结核免疫效应的初步研究

目的探讨小鼠皮内注射分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌后,小鼠腹腔巨噬细胞是否被激活,以及激活后氮氧化物的产生、抗结核细胞因子的表达。比较研究分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌激活小鼠腹腔巨噬细胞的抗结核免疫应答过程及免疫效应。方法用分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌、卡介苗菌和生理盐水分别皮内注射小鼠30d、60d后,分别采用Griess法、化学法、ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO、H2O2以及IL-12、TNF-α的表达。结果分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌皮内接种小鼠后,能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌表达IL-12和TNF-α,与卡介苗菌组相比较,无明显差异;与生理盐水组比较,其差异均有统计学意义(P<0.05)。分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌皮内接种小鼠后,也能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、H2O2,与卡介苗菌组相比较,无明显差异,与未免疫组比较具有统计学意义(P<0.05)。结论分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌皮内接种小鼠后,能诱导小鼠腹腔巨噬细胞活化并产生较强的抗结核免疫效应,但该效应与卡介苗菌无明显差异。

重组人白介素2-卡介苗对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞体外杀伤活性的影响

目的：研究能分泌人白细胞介素２的重组卡介苗（ｒＢＣＣ－ＩＬ－２）对小鼠腹腔巨噬细胞体外杀伤活性功能的改变，探讨ｒＢＣＧ－ＩＬ－２对宿主免疫功能的影响。方法：采用基因工程技术和电转化技术构建卡介苗，采用ＭＴＴ法测定小鼠腹腔巨噬细胞体外的杀伤活性。结果：ｒＢＣＧ－ＩＬ－２组小鼠腹腔巨噬细胞杀伤活性明显大于ｒＢＣＧ组和对照组，且巨噬细胞的杀伤活性在一周内达到最大。结论：ｒＢＣＧ－ＩＬ－２能提高巨噬细胞的杀伤活性，是一种很有前景的生物制剂。

卡介苗菌株和结核分枝杆菌H37Ra菌株原生质体的制备研究

分别以卡介苗菌株(BCG)及结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株(H37Ra)为受体菌,制备上述两种菌株的原生质体,同时通过优化细菌菌龄、酶解浓度、酶解温度以及酶解时间等影响因素,探索出制备原生质体形成及再生的最优条件。结果显示:摸索出制备BCG和H37Ra菌株的原生质体条件:在对数生长期的两亲本菌株,经0.01 mol/L EDTA,0.01%β-巯基乙醇溶液预处理;酶解浓度为12 mg/mL,酶解温度为37℃,酶解时间为5 h,可制备出活性较高的两种菌株的原生质体。由此可知,成功制备了BCG与H37Ra菌株的原生质体,并能在高渗固体培养基上再生。本实验为进一步研究该两种菌株原生质体融合试验奠定了基础。

弓形虫Prugniaud株诱导的对小鼠黑色素瘤抑制作用的体内实验研究

目的探讨弓形虫Prugniaud实验感染增强宿主的非特异性抗肿瘤效应,检测Prugniaud株单独感染或联合卡介苗(BCG)对小鼠恶性黑色素瘤的抑制作用。方法体内实验用绿色荧光标记的转基因小鼠每组9只,荷瘤后单独感染弓形虫Prugniaud株或联合BCG,比较肿瘤生长情况,计算抑瘤率,并用流式细胞仪检测各组小鼠肿瘤细胞的凋亡率。RT-PCR检测肿瘤组织中VEGF的mRNA的表达水平。结果 B16组、BCG/B16组、TG/B16组、TG/BCG/B16组小鼠瘤重分别为3.237±0.552g、2.461±0.320g、1.521±0.263g、1.069±0.444g,各组肿瘤凋亡率分别为7.42±2.09%、9.27±2.10%、23.32±4.37%、43.88±6.33%;光镜下TG/B16组和TG/BCG/B16组小鼠能明显抑制肿瘤细胞生长,并且VEGF120/β-actin和VEGF120/β-actin低于其他组(TG/B16:0.167±0.011,0.190±0.015);TG/BCG/B16:0.140±0.015,0.171±0.011)。结论弓形虫感染对小鼠黑色素瘤有抑制作用,降低血管内皮生长因子mRNA表达量,并且在BCG联合作用下效果得到增强。

鹿结核病野毒株与卡介苗差异基因基因文库的构建

应用四碱基限制性内切酶对鹿结核病流行株和卡介苗基因组分别酶切,以鹿结核流行株酶切产物为testerDNA,卡介苗酶切产物为driver DNA,testerDNA接头连接后与driver DNA进行抑制性消减杂交。将获得的消减PCR产物与pMD-18连接,JM109感受态细胞,进行蓝白斑筛选。结果表明,RsaI酶切产生的酶切产物在0.1～2.0 kb之间,将消减PCR产物克隆后,挑取208个转化子,构建了鹿结核病流行株与卡介苗的差异基因文库。结果表明,应用抑制性消减杂交技术,构建鹿结核病流行株与卡介苗基因组差减文库,可为鹿结核病自然感染和卡介苗免疫的鉴别诊断及鹿结核病的综合防治奠定基础。

重组卡介苗及猪苓多糖对荷瘤小鼠巨噬细胞NO释放量的影响

目的 观察重组卡介苗 (rBCG)和中药猪苓多糖(PPS) ,对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的影响。方法将黑色素瘤细胞株B16接种于小鼠左大腿外侧皮下 ,建立荷瘤小鼠模型 ,分别用rBCG IL 2、rBCG IL 2 +PPS和PPS进行局部治疗。于给药后第 1、2、3和 5wk处死小鼠 ,用NO酶法测定小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的水平 ,并观察不同实验组瘤体的变化。结果 rBCG IL 2组小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的水平最高。与对照组相比较 ,PPS组小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的水平在第 1wk与第 2wk增高 ,第 3wk起与对照组释放的NO水平没有差异。rBCG IL 2组小鼠随给药时间的延长 ,皮下瘤体逐渐缩小。PPS组小鼠瘤体在给药后第 1wk和第 2wk生长缓慢 ,第 3wk起瘤体生长速度明显增加。结论 rBCG IL 2与PPS能提高小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的水平 ,rBCG IL

BCG-PSN对荷瘤小鼠IL-2水平及肿瘤生长的影响

将卡介菌多糖核酸（ＢＣＧ＿ＰＳＮ）及肿瘤坏死因子（ＴＮＦ＿α）用于荷肉瘤（Ｓ１８０）小鼠的治疗。结果证明，ＢＣＧ＿ＰＳＮ（０５ｍｇ／ｍｌ）及ＴＮＦ＿α（１０００Ｕ／ｍｌ）均能显著抑制Ｓ１８０实体瘤的生长，抑瘤率分别为５８１０％和３６２５％，抑瘤率与荷瘤鼠脾细胞的ＩＬ＿２诱生水平呈正的直线相关。ＢＣＧ＿ＰＳＮ还能显著延长荷Ｓ１８０腹水瘤鼠的存活期，生命延长率达３１５％。ＴＮＦ可能由于它的毒副作用而使其抑瘤效果低于ＢＣＧ＿ＰＳＮ，且与后者无协同作用。

新型结核病疫苗融合菌株制备及其免疫学特性的研究

目的观察由卡介苗(BCG)与结核分枝杆菌国际标准弱毒株H37Ra(H37Ra菌株)构建的融合菌株(B/R菌株)生长特性及其在免疫小鼠体内的生长情况。方法分别测定用7H9培养基培养3、6、9、12、15、18、21、24、27和30d的B/R菌株、BCG和H37Ra菌液在波长600nm处的A值,以时间为横坐标,A600值为纵坐标,绘制细菌生长曲线。将C57BL/6小鼠随机分为B/R菌株、BCG和H37Ra菌株3组,每组30只,分别皮下接种B/R、BCG和H37Ra菌液0.1ml(含活菌数为1.0×106个),免疫15、30、45、60和75d后无菌条件下取小鼠肝脏、脾脏和肺脏,制成脏器组织匀浆,接种罗氏固体培养基斜面,培养20d后计数各脏器菌落数(Log10cfu)。结果细菌生长曲线显示,B/R菌株的适应调整期较长,6d后进入生长对数期,27d后进入稳定期,生长周期约30d左右。免疫15、30、45、60和75d小鼠肝脏、脾脏、肺脏定植细菌数(Log10cfu)B/R菌株组高于BCG和H37Ra菌株组。小鼠肝脏定植细菌数(Log10cfu)B/R菌株组与BCG和H37Ra菌株组比较差异无统计学意义(P>0.05);免疫15、60及75d小鼠脾脏定植细菌数(Log 10cfu)B/R菌株组与BCG和H37Ra菌株组比较差异有统计学意义(P<0.05),免疫30和45d小鼠脾脏定植细菌数(Log10cfu)B/R菌株组与BCG组比较差异有统计学意义(P<0.05),与H37Ra菌株组比较差异无统计学意义(P>0.05);免疫15和45d小鼠肺脏定植的细菌数(Log10cfu)B/R菌株组与BCG和H37Ra菌株组比较差异有统计学意义(P<0.05),免疫30、60和75d小鼠肺脏定植细菌数(Log10cfu)B/R菌株组与BCG组比较差异有统计学意义(P<0.05),与H37Ra菌株组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 B/R菌株的生长周期为30d,在小鼠体内至少存活2个月,定植能力较强。

我国生产用卡介菌的传代稳定性

目的研究我国生产用卡介菌上海株在传代过程中分子遗传学特性的稳定性。方法应用多重PCR法,对我国生产用卡介菌上海株工作种子批及其不同代次菌的各缺失区、插入序列IS6110及基因座SenX3-RenX3串联重复序列拷贝数进行检测。结果我国生产用卡介菌上海株的工作种子批及其第6、9、12代菌均缺失RD1、RD2,未缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDenmark/Glaxo;含有1个IS6110插入序列和3个SenX3-RenX3基因座串联重复序列。结论我国生产用卡介菌上海株在传12代以内,其分子遗传学特性是稳定的。

国内外卡介菌的分子遗传学特性

目的比较我国生产用卡介菌上海菌株与国际常用卡介菌亚株(巴斯德1173P2株、法国F6株、丹麦1331株、丹麦2株、日本172株、Connaught)在分子遗传学上的差异。方法应用PCR和多重PCR方法,对国内外不同卡介菌的各缺失区(RD1、RD2、RD8、RD14、RD16、nRD18、RDDenmark/Glaxo)、插入序列IS6110拷贝数及基因座SenX3-Regx3串联重复序列拷贝数进行检测。结果我国生产用卡介菌上海菌株(BCG Chinese)缺失RD1和RD2,不缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDen-mark/Glaxo,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有3个串联重复序列,PCR产物为353bp;巴斯德1173P2株缺失RD1、RD2、RD14和nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;法国F6株缺失RD1、RD2和nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;丹麦1331株缺失RD1、RD2及RDDenmark/Glaxo,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;丹麦2株与丹麦1331株相似,只是SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列和3个串联重复序列并存的现象;日本172株只缺失RD1,RD16只显示401bp的产物,含有2个IS6110插入序列;Connaught株缺失RD1、RD2、RD8及nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有1个串联重复序列。结论我国生产用卡介菌上海菌株与国外其他卡介菌亚株在分子遗传学特性上有一定的差异。

新型结核病疫苗菌株在小鼠体内的毒性及安全性研究

目的观察由卡介苗(简称BCG)和结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra(简称H37Ra菌株)为亲本菌株构建的融合菌株(简称B/R菌株)接种C57BL/6小鼠后在小鼠体内的毒性及其安全性。方法将204只C57BL/6小鼠随机分为生理盐水组(36只)、BCG组(56只)、B/R组(56只)和H37Ra组(56只);分别皮内接种无菌生理盐水、BCG菌悬液、B/R菌株菌悬液、H37Ra菌株菌悬液0.1ml(含活菌数为1.0×106个),观察各组小鼠生存基本情况并记录接种后第3、6、9、12、15、18周小鼠体重;分别于接种后第2、3、6、9、12周取BCG组、B/R组、H37Ra组小鼠各4只,处死后摘取小鼠完整肺脏和脾脏称重后分别制成脏器组织匀浆,接种于罗氏培养基培养20d,计数各脏器菌落数(CFU);分别于接种后第3、6、9、12、15、18周,四组分别随机各取6只小鼠,脱颈处死后称取体重,摘取小鼠肺脏及脾脏在组织固定液中固定(固定前脾脏称重),48h后制作病理切片,HE染色后观察小鼠肺脏、脾脏的病理变化,并计算各组小鼠各时间点的脾脏系数。结果 (1)4组小鼠接种后一般生存状态良好,接种部位未出现明显溃疡、脓疱等。从接种后第1d^18周各组小鼠均无死亡,生存率为100%。接种后第3周、6周,四组之间小鼠体重相比差异无统计学意义(P>0.05),接种后第9周、15周,H37Ra组小鼠体重低于生理盐水组(P<0.05),接种后第12周,BCG组小鼠体重低于生理盐水组(P<0.05),接种后第18周,H37Ra组小鼠体重分别与生理盐水组、BCG组、B/R组相比均降低(P<0.05);(2)接种后第2周、3周、6周时小鼠脾脏定植细菌数(Log10cfu),H37Ra组、B/R组均较BCG组升高(P<0.05);B/R组与H37Ra组比较差异无统计学意义(P>0.05)。接种后第9周小鼠脾脏定植菌数(Log10cfu),H37Ra组较BCG组升高(P<0.05),B/R组分别与H37Ra组、BCG组相比差异无统计学意义(P>0.05)。接种后第12周小鼠脾脏定植细菌数(Log10cfu),H37Ra组、B/R组均较BCG组升高(P<0.05),B/R组较H37Ra组降低(P<0.05)。(3)在接种后第2周小鼠肺脏定植菌数(Log10cfu),B/R组较BCG组升高(P<0.05);B/R组、BCG组分别于H37Ra组相比差异无统计学意义(P>0.05)。接种后第3周三组小鼠肺脏定植菌数(Log10cfu)之间相比差异无统计学意义(P>0.05);接种后第6周小鼠肺脏定植菌数(Log10cfu),H37Ra组较BCG组升高(P<0.05),B/R组分别与H37Ra组、BCG组相比差异无统计学意义(P>0.05);接种后第9周小鼠肺脏定植菌数(Log10cfu),H37Ra组较BCG组升高(P<0.05);B/R组较H37Ra组降低(P<0.05),B/R组与BCG组相比差异无统计学意义(P>0.05);接种后第12周小鼠肺脏定植菌数(Log10cfu),B/R组、H37Ra组均较BCG组升高(P<0.05),B/R组与H37Ra组相比差异无统计学意义(P>0.05);(4)各时间点生理盐水组小鼠肺脏、脾脏均呈现正常病理征象。接种后第3~18周BCG组、H37Ra组及B/R组小鼠肺脏均表现出不同程度的炎细胞浸润和气道上皮细胞局部脱失,肺泡间隔增宽,部分肺间质水肿,但肺泡腔无改变,均未出现结核结节,第3~18周BCG组、H37Ra组和B/R组小鼠脾脏均有不同程度白髓比例升高,淋巴小结体积增大,动脉周围淋巴鞘增厚;红髓扩张淤血,巨噬细胞增多等改变;(5)接种后第3周、6周小鼠脾脏系数,BCG组、H37Ra组及B/R组均较生理盐水组明显升高(P<0.05);接种后第9周小鼠脾脏系数,H37Ra组及B/R组均较生理盐水组明显升高(P<0.05),BCG组与生理盐水组相比差异无统计学意义(P>0.05),接种后第12周小鼠脾脏系数,H37Ra组较生理盐水组显著升高(P<0.01),B/R组较生理盐水组升高(P<0.05);BCG组较H37Ra组降低(P<0.05)。接种后第15周、18周四组小鼠脾脏系数之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 B/R菌株的毒性较H37Ra菌株降低,与卡介苗相当,其使用安全性较好。

上海丹麦_Ⅱ（D_2）卡介苗菌株的免疫效果与反应

本文介绍了上海丹麦Ⅱ（Ｄ２）菌株保存传代适应过程，及其对小鼠免疫保护率和人体接种阳转率与接种反应的情况，并推荐ＰＢ３０２ＰＳⅡ甲１０种子批菌种为我国统一菌株的候选菌种。

卡介苗生产用菌株全基因组测序

【目的】对我国生产用卡介苗上海D2PB302菌株(简称“卡介苗上海D_(2)株”)全基因组进行测序及部分基因功能预测。【方法】取卡介苗上海D2株(编号D2-JIA12-1)样品DNA,采用第三代测序平台PacBio RSⅡ进行全基因组测序,并结合二代测序数据得到最终的基因组序列。对基因序列分别进行rRNA预测和tRNA预测,对预测的基因进行基本的功能注释,并选取其中肺内表达结核分枝杆菌(MTB)在小鼠体内感染过程中高表达编码(IVE-TB)抗原基因序列、减毒结核分枝杆菌疫苗(MTBVAC)作为目的序列与结核分枝杆菌H37Rv序列(NC_000962.3)比对。【结果】卡介苗上海D2株基因组序列长度为4 045 232 bp,GC含量为65.66%。Glimmer3.02软件共预测出4 259个基因,基因的平均长度为933 bp,其中1 783个基因是假定蛋白,其余2 476个基因具有明确的生物学功能,与毒力基因库比对后得到144个毒力基因,包含29个Ⅶ型分泌系统基因,10个N端具有保守的脯氨酸-谷氨酸(PE)和脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸(PPE)序列的蛋白质家族基因。【结论】明确了卡介苗上海D_(2)株全基因序列的背景资料,并为后续开展主要抗原基因的遗传稳定性检测奠定了广泛的基础。