miR-222通过调控BCL2L13基因促进HBx-HepG2细胞生长

目的:探讨HBx-Hep G2细胞中微小RNA-222(mi R-222)对BCL2L13基因表达的调控作用以及对细胞生长和凋亡的影响,并研究其潜在的分子作用机制。方法:利用实时荧光定量PCR检测mi R-222的表达水平;MTT和集落形成实验检测细胞的生长;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;构建BCL2L13 3’UTR双萤光素酶报告载体,通过采用双萤光素酶报告实验验证mi R-222的靶基因。结果:与正常的肝细胞L02相比,mi R-222在HBx-Hep G2细胞过量表达(P<0.05)。mi R-222过表达可促进HBx-Hep G2细胞的生长,改变细胞周期,降低细胞的凋亡率;mi R-222表达下调可抑制HBx-Hep G2细胞的生长,改变细胞周期,增加细胞的凋亡率,和对照组相比差异有统计学显著性(P<0.05)。与正常肝细胞L02相比,BCL2L13在HBx-Hep G2细胞表达下调(P<0.05);mi R-222表达下调可促进BCL2L13的表达(P<0.05)。双萤光素酶报告实验和pc DNA3.1-BCL2L13转染实验结果提示mi R-222可以通过作用于BCL2L13的3’UTR区,负向调控其表达,从而促进细胞的生长。结论:mi R-222可以通过靶向调控BCL2L13基因进而促进HBx-HepG2细胞的生长。

草原红牛Bcl2L13的CDS克隆及其在不同组织的表达规律研究

本研究旨在初步探究草原红牛Bcl2L13的基因功能,并对其进行生物信息学分析,检测Bcl2L13在草原红牛不同组织中的表达差异。本实验以草原红牛为研究对象,根据GenBank公布的牛Bcl2L13基因序列(GenBank登录号:NM001078082.2)设计引物,PCR扩增获得Bcl2L13的完整CDS并进行测序,利用分析软件进行序列同源性比对并构建系统进化树;获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、蛋白亲疏水性和磷酸化位点;预测蛋白二级结构并进行蛋白质三级结构模型构建;采用实时荧光定量PCR方法检测Bcl2L13基因在草原红牛各组织中的表达规律。结果显示:草原红牛Bcl2L13基因核苷酸序列与普通牛和牦牛的同源性高(100%和99.3%),与瘤牛和亚洲水牛的同源性较高(91.8%、90.5%);Bcl2L13基因CDS大小为839bp,编码279个氨基酸,该蛋白质分子式为C1348H2108N348O439S5,分子量为30.374 ku,理论等电点为4.51,蛋白质不稳定指数为77.71,总平均亲水性为-0.250。亚细胞定位分析表明,Bcl2L13蛋白分布在内质网(4.3%)、线粒体(4.3%)、过氧化物酶体(8.7%)、细胞质(65.2%)、细胞骨架(4.3%)、细胞核(13.0%);磷酸化位点分析发现Bcl2L13蛋白存在33个磷酸化位点;二级结构主要形式有α-螺旋(22.4%)、β-转角(12.1%)、β折叠(31.0%)、无规则卷曲(34.5%),与三级结构预测相同;Bcl2L13在背最长肌中表达量最高,在肺组织中表达量最少。综上,Bcl2L13基因在生物进化过程中具有低保守性,其编码的氨基酸组成的蛋白质结构不稳定,属于水溶性蛋白,主要在细胞质中发挥作用,在草原红牛不同组织的表达量有显著差异。