8株布氏杆菌BCSP31基因的序列分析

参照GenBank中布氏杆菌的全基因组序列,设计一对特异性引物,通过PCR方法,扩增了8株来自3个布氏杆菌种的布氏杆菌表面蛋白31(BCSP31)全基因。PCR产物经克隆和序列分析后发现,该基因非常保守,8株不同菌株间的同源性高于99.3%;进化关系分析显示,5株中国来源的菌株(S2,M5,M111,M28,A387)显示了最近的同源关系,其中2个弱毒菌株S2和M5的BCSP31基因序列100%同源。3株外国来源的菌株(S19,2308,Rev.1)中,S19和2308同源性为100%。Rev.1与其他7株布氏杆菌BCSP31基因均有较大的差异。序列分析结果表明,BCSP31基因序列差异与布氏杆菌的种属和毒力无相关性。

流产布鲁氏菌BCSP31基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达

设计1对引物,突变除去布鲁氏菌BCSP31(细胞表面蛋白31)基因的N端信号肽氨基酸序列,经NotⅠ和EcoRⅠ酶切后与相同处理的表达载体pGEX-4T-1连接,转化BL21(DE3)感受态细胞。酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性克隆,测序证明其阅读框完全正确。用IPTG诱导表达构建成功的阳性克隆,对产物进行SDS-PAGE和Western-blotting检测,发现表达产物出现预期分子量57 kD的融合蛋白,该蛋白能与牛流产布鲁氏菌阳性血清发生反应,进一步证明目的蛋白主要以可溶性形式存在,表达量约占总蛋白的40%,应用GST琼脂糖凝胶FF纯化可得到纯度较高的表达产物。

羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达

目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和L7/L12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原L7/L12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入pGEM7Zf(+)中测序并进行分析。将3种基因片段亚克隆入pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定。结果SDS-PAGE结果表明3个目的蛋白均以融合蛋白的方式成功表达,在相对分子量57kDa、49kDa、38kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白分别占全菌蛋白的42%、36%、40%。Western-blot证实3种融合蛋白均能被布鲁氏菌免疫兔血清识别。结论成功构建了3种蛋白的表达载体并进行了高效表达,3种蛋白均具有良好的免疫原性。

布鲁菌种属鉴定多重PCR方法的建立及初步应用

用BCSP31作为布鲁菌属特异性基因,以IS711基因拷贝数差异作为布鲁菌种间特异性标志,建立了布鲁菌种属特异性的多重PCR鉴定方法。用建立的多重PCR方法对11株(牛种A19,A544,A387;羊种M111,M28,M16;犬种RM6/66;绵羊种63/290;猪种S2,rS2,S1330)不同种来源的布鲁菌菌体和基因组进行鉴定,结果牛种菌能扩增大小分别为494,223,178bp3条带,羊种菌能扩增出大小分别为733,223,178bp3条带,犬种菌能扩增出大小分别为223,178bp2条带,绵羊种菌能扩增出大小分别为976,223,178bp3条带,猪种菌能扩增出大小分别为285,223,178bp3条带,均与预期一致;而作为对照的大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、流产沙门菌和都柏林沙门菌,均未扩增出任何条带。结果表明,本研究所建立的方法具有良好的特异性,能够区分不同种源的布鲁菌,可用于布鲁菌种属的快速鉴定和流行病学调查。

布鲁氏菌RPA-SYBR Green Ⅰ快速检测方法的建立与应用

为了建立一种新型、稳定、可普遍应用的布鲁氏菌检测方法,试验将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)方法与SYBR GreenⅠ结合,根据布鲁氏菌bcsp31基因序列保守区设计1对特异性引物和1条标有biotin、dSpacer、C3 Spacer的特异性探针,建立一种可以检测布鲁氏菌的RPA-SYBR-GreenⅠ方法,对该方法的反应条件和反应体系进行优化,并分析敏感性和特异性,并用该方法和ELISA方法对临床样品进行检测。结果表明:试验成功构建出布鲁氏菌RPA-SYBR-GreenⅠ检测方法。该方法的最佳反应条件为手掌中孵育12 min,闭合手掌即可启动RPA扩增;引物与探针的最佳比例为2.5∶1;最低检测限为1×10^(1)cfu/mL,能够特异地检测出布鲁氏菌;对临床样品的检测结果与ELISA方法一致。说明试验建立的布鲁氏菌RPA-SYBR-GreenⅠ检测方法特异性强,敏感性高,检测速度快,操作简单。

过表达UGPase基因和BCSP31基因的重组流产布氏杆菌的构建与鉴定

为提高流产布氏杆菌S19疫苗株的免疫保护效果,分别扩增流产布氏杆菌UGPase基因和BCSP31基因,将其插入含有双启动子pR/pL序列的广宿主穿梭质粒pBBR1MCS-PT中,电转至流产布氏杆菌S19感受态细胞并经抗性基因筛选,采用PCR法对重组菌株的遗传稳定性进行检测,利用蛋白分析手段对目的基因的表达情况进行分析。PCR检测结果显示,构建的重组流产布氏杆菌S19-UGPase株和S19-BCSP31株的遗传性状稳定。SDS-PAGE与Western-blot结果显示,在33和31ku处可见明显条带,且与His标签抗体的反应位置一致,表明目的蛋白获得正确表达。结果表明,构建的过表达重组流产布氏杆菌S19-UGPase株和S19-BCSP31株能够稳定表达目的基因,为下一步开展S19-UGPase株和S19-BCSP31株免疫效果的评价奠定了基础。

布鲁氏菌RPA-LFD快速检测方法的建立与应用

为建立一种新型、稳定、可普遍应用的诊断布病的方法,将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与胶体金侧向流试纸条技术(lateral flow dipstick,LFD)相结合。根据布鲁氏菌bcsp31基因序列保守区设计1套标有生物素Biotin的特异性引物和1条标记dSpacer、C3 Spacer的特异性探针,通过对反应条件、体系的优化,以及对敏感性、特异性以及模拟样本的分析,最后进行临床应用,建立一种可以检测布鲁氏菌的RPA-LFD方法。结果显示,成功建立了布鲁氏菌RPA-LFD检测方法,最佳反应条件为闭合手掌中孵育12 min;引物与探针的最佳比为3.5∶1;RPA-LFD方法的最低检测限为5.89 CFU/m L,能够特异地检测出布鲁氏菌,检测大肠杆菌等其他细菌结果均为阴性;用RPA-LFD方法检测模拟样本和临床样品的结果与ELISA方法一致。上述结果表明,本研究建立的布鲁氏菌RPA-LFD检测方法特异性强、灵敏性高、操作简单,可广泛应用于临床检测。