EBV-BHRF1基因阳性与阴性细胞株对3种诱导凋亡因素抵抗性差异的研究

目的观察ＥＢＶ┐ＢＨＲＦ１基因阳性（ＳＵＮＥ┐１、Ｒａｊｉ和Ｂ９５┐８）与阴性（Ｋ５６２、ＹＡＣ）细胞株对３种诱导细胞凋亡（ａｐｏｐ┐ｔｏｓｉｓ）因素（无血清培养４８小时，４３℃作用１０分钟或２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ地塞米松作用２４小时）的抵抗力差异。方法ＰＣＲ扩增ＥＢＶ┐ＢＨＲＦ１基因片段诱导后经电镜及电泳ＤＮＡ检测细胞凋亡。结果分别从Ｂ９５┐８、Ｒａｊｉ及人低分化鼻咽癌细胞株（ＳＵＮＥ┐１）ＤＮＡ中扩增出ＥＢ病毒的ＢＨＲＦ１全基因片段，而Ｋ５６２、ＹＡＣ细胞株则不含该基因片段。分别经上述３种方法处理后，前３种细胞株的形态及ＤＮＡ电泳行为未发生明显改变，而后２种细胞株则出现典型的细胞凋亡特征，即细胞核凝缩，细胞膜及细胞器基本保持完整；ＤＮＡ电泳出现梯形（Ｌａｄｄｅｒ）条带。

BHRF1反义寡核苷酸对BHRF1-CNE2细胞生存能力的影响

目的：探讨ＢＨＲＦ１ 反义寡核苷酸对表达ＢＨＲＦ１ 的鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２ 生存能力的影响。方法：检测反义阻断ＢＨＲＦ１ 表达后ＢＨＲＦ１－ＣＮＥ２细胞在喜树碱作用下增殖能力和凋亡指数的变化。结果：在喜树碱作用下，应用ＢＨＲＦ１ 反义寡核苷酸组的癌细胞较对照组的增殖率下降，凋亡率增高。结论：反义阻断ＢＨＲＦ１的表达可降低ＣＮＥ２细胞的生存能力。

BHRF1基因表达对CNE2细胞生长的影响

目的：观察ＥＢ病毒基因ＢＨＲＦ１的表达对鼻咽癌细胞生存能力的影响。方法：通过构建携有ＢＨＲＦ１的高表达载体，并转染低分化鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２细胞。检测转染后癌细胞周期各时相分布的改变和在缺乏营养条件下的生长情况。结果：ＢＨＲＦ１的表达能使Ｇ１期细胞百分比升高，Ｓ期细胞百分比下降，癌细胞在缺血清条件下生存时间延长。结论：ＢＨＲＦ１的表达能促使鼻咽癌细胞周期的重新分布。

shRNA表达载体沉默BHRF1对鼻咽癌CNE2细胞生长、凋亡及细胞周期的影响

目的探讨沉默shRNA对鼻咽癌CNE2细胞生长、凋亡及细胞周期的影响。方法构建负载BHRF1 shRNA的慢病毒载体并转染至CNE2细胞,采用MTT法观察转染24、48、72及96h的增殖抑制率,采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测转染48h的细胞凋亡率及细胞周期。结果 BHRF1 shRNA可增加CNE2细胞增殖抑制率,96h时达最大,各时间点的差异有统计学差异(P<0.05);转染48h后的凋亡率增加,G1/G0期细胞比例均高于对照组,S、G2/M期细胞比例低于对照组(P<0.05)。结论沉默BHRF1可抑制细胞增殖并诱导G1/G0期阻滞及细胞凋亡。

EB病毒早期基因BHRF1转基因模型鼠的建立

目的构建稳定表达EB病毒早期基因BHRF1蛋白的重组载体,通过显微注射法建立BHRF1转基因鼠模型。方法自EBV阳性细胞系B95-8提取总RNA,应用RT-PCR扩增BHRF1基因,然后与pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1-BHRF1重组载体。重组载体用NruⅠ和DraⅢ双酶切,电泳后纯化回收长约2000 bp的目的片段溶于显微注射缓冲液。从超排小鼠取健康受精卵,通过显微注射技术,将纯化的CMV+BHRF1+polyA DNA片段注射入小鼠受精卵,短暂培养后选择健康受精卵移入假孕母鼠输卵管内。采用PCR检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性首建鼠。结果经PCR、限制性内切酶鉴定及测序证实pcDNA3.1-BHRF1重组载体构建成功,DraⅢ和NruⅠ双酶切获得长约2 000 bp的CMV+BHRF1+polyA DNA片段。自18只见栓超排小鼠获取健康受精卵480枚,分别注入纯化的目的片段,经短暂培养后390枚受精卵仍健康,移入14只假孕母鼠输卵管内,11只受孕,产下74只子鼠。PCR检测子鼠鼠尾DNA获得16只阳性首建鼠,阳性率为21.6%(16/74)。结论本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型。

EB病毒早期基因BHRF1转基因小鼠纯合子建立及建系

目的构建整合有EB病毒(EBV)早期基因BamHI-H右向读码框1(BHRF1)基因纯合子转基因小鼠。方法通过显微注射技术构建BHRF1阳性首建鼠F0共16只,将转基因小鼠与正常小鼠交配,得到子代F1小鼠,PCR技术检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性鼠。阳性鼠再与同系阴性鼠杂交得到F2小鼠,筛选出F2小鼠中的阳性鼠近交得F3小鼠。筛选出F3小鼠中的纯阳性鼠进行近交,得到纯阳性F4小鼠。F4小鼠再近交得到纯阳性F5小鼠。结果经PCR及测序证实,F4、F5小鼠均为BHRF1阳性鼠,测序结果经blast比对,与BHRF1基因完全相同。结论本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,并成功筛选出纯阳性BHRF1转基因小鼠,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型。

EBVaGC中LMP1和BHRF1的表达与血管生成淋巴管生成的关联性研究

目的探讨EB病毒相关性胃癌中LMP1和BHRF1的表达与血管生成、淋巴管生成的关系。方法选取EB病毒相关性胃癌组织标本采用免疫组化方法检测LMP1、BHRF1、VEGF-C、LYVE-1和CD34的表达水平,分析其可能存在的关系。结果 30例EBVaGC组织中不同TNM分期、有无周围淋巴结转移的LMP1蛋白的表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05);BHRF1表达和TNM分期、有无周围淋巴结转移有关联(P<0.05)。VEGF-C表达与周围淋巴结转移有关联(P<0.05);EBVaGC中MVD在不同TNM分期之间有统计学意义(P<0.05);MLVD与在不同TNM分期和有无周围淋巴结转移之间有统计学意义(P<0.05)。BHRF1的表达与MVD无统计学关联,而与MLVD有统计学关联(P<0.05)。VEGF-C阳性表达的19例EBVaGC组织中,MVD和MLVD均明显高于阴性组,两组比较其差异具有显著的统计学意义(P<0.05)。结论 EB病毒相关性胃癌中LMP1的表达率低,BHRF1的表达率高,可能与EB病毒相关性胃癌较少发生淋巴结转移有关。VEGF-C高表达说明VEGF-C可能参与EBVaGC的血管和淋巴管生成,其高表达间接促进肿瘤细胞沿新生的淋巴管迁徙和转移。

EB病毒BHRF1基因慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的:构建并制备能够有效表达EB病毒BHRF1基因的重组慢病毒载体,观察BHRF1表达对人胚肺成纤维细胞(KMB17)凋亡的影响。方法:采用RT-PCR法,从B95-8细胞扩增EBV BHRF1基因,克隆至pWPI GW慢病毒载体上,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装出重组慢病毒。将纯化后的重组慢病毒直接感染293T和KMB17细胞,荧光显微镜、实时定量RT-PCR、免疫印迹等方法检测BHRF1在细胞中的表达水平。流式细胞仪检测BHRF1表达对凋亡诱导剂或无血清培养诱发KMB17细胞凋亡的影响。结果:重组慢病毒介导BHRF1在293T和KMB17细胞内获得表达,能有效地抑制KMB17细胞的凋亡。结论:成功构建了表达BHRF1基因的重组慢病毒载体。

BHRF1蛋白在口腔鳞癌中的表达及其意义

目的:观察EB病毒BHRF1蛋白在口腔鳞癌的表达情况,探讨其临床意义.方法:收集临床标本共70例,其中正常口腔黏膜10例、口腔鳞癌60例,应用免疫组化SP法检测所有标本中BHRF1蛋白表达水平,并对结果进行统计分析.结果:口腔鳞癌组中BHRF1蛋白的阳性表达率为53.33%(32/60),显著高于正常口腔黏膜组(P<0.05).其中,口腔鳞癌高分化组的阳性表达率为59.26%(16/27),中低分化组为48.48%(16/33),两者之间无统计学差异(P=0.815).结论:BHRF1参与口腔鳞癌的发生发展过程.

ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖

目的针对ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖以分析癌症靶向治疗的前景。方法通过基因测序法鉴定所构建的siRNA表达载体。用四唑盐比色(MTT)法、流式细胞术评价转染siRNA后对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响。结果与NC-shRNA组相比,BHRF1-shRNA组细胞凋亡增加,凋亡率为(31.51±1.59)%。结论由慢病毒载体介导的shRNA表达载体进入细胞后,可以有效下调BHRF1基因表达水平,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

地塞米松对SUNE-1和B_(95-8)细胞株中EB病毒BHRF1基因转录水平的影响

目的：以Ｋ５６２细胞为阴性对照，观察ＳＵＮＥ－１和Ｂ９５８两种含ＥＢＶ－ＢＨＲＦ１基因的肿瘤细胞株在２×１０６ｍｏｌ／Ｌ地塞米松（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ＤＥＸ）作用１８ｈ后，细胞内ＥＢＶ－ＢＨＲＦ１基因转录水平的改变。方法：细胞ＲＮＡ的提取、ＲＮＡ的点杂交（Ｄｏｔｂｌｏｔ）及反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）。结果：上述两种肿瘤细胞在２×１０６ｍｏｌ／Ｌ地塞米松作用１８ｈ等诱导细胞凋亡的条件下，细胞内ＥＢＶ－ＢＨＲＦ１基因的转录水平（ｍＲＮＡ）明显提高。结论：本结果初步显示ＥＢＶ－ＢＨＲＦ１基因的转录与宿主细胞抵抗凋亡的关系密切。

BHRF1基因表达对鼻咽癌细胞集落形成能力的影响

目的了解EB病毒编码基因BHRF1的表达对鼻咽癌细胞抗凋亡能力的影响。方法本研究通过构建携有BHRF1的高表达载体,并转染鼻咽癌细胞株CNE2细胞,观察转染后的癌细胞在喜树碱作用前后软琼脂集落形成情况,结果未经喜树碱处理的三种细胞的集落形成率间的差别无显著意义(P>0.05);经喜树碱处理的三种细胞间,BHRF1-CNE2细胞的集落形成率多于两对照组(0.01<P<0.05),结论提示BHRF1的表达能促进鼻咽癌细胞抵抗喜树碱抑制其DNA合成的作用,而阻止细胞凋亡的发生。

BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的构建BHRF1基因与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体及获得稳定表达BHRF1的慢病毒的方法。方法通过实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法从鼻咽癌组织中扩增获得BHRF1的基因全长CDS序列,并克隆于带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体中,酶切验证测序正确后,将质粒pWPXL-hBHRF1-IR ES-GFP与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,将浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察下293T细胞的绿色荧光表达及转染效率。结果电泳鉴定与目的基因表达条带完全吻合,测序结果显示扩增得到的BHRF1序列与GenBank公布的参考序列完全一致,双酶切和测序结果证明BHRF1已正确地克隆到慢病毒表达载体中,包装后慢病毒颗粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光表达,转染效率>90%。结论成功构建了BHRF1与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究BHRF1基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。

ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究

目的观察BHRF1 shRNA质粒载体转染对人鼻咽癌CNE2细胞中的BHRF1基因沉默及细胞增殖和凋亡的影响,以及肿瘤细胞对放射敏感性的变化。方法利用RNAi技术将负载BHRF1 shRNA的质粒载体转染至人鼻咽癌CNE2细胞,一组为BHRF1 shRNA质粒载体转染过的CNE2细胞(观察组),未进行转染的CNE2细胞确定为对照组,经RT-PCR扩增人鼻咽癌组织中BHRF1 cDNA片段,RT-PCR和Western blot检测BHRF1基因的蛋白水平的表达。并且利用顺铂进行实验,观察使用顺铂后,BHRF1 shRNA转染后的肿瘤细胞是否对放射敏感性有变化。结果 BHRF1 shRNA转染鼻咽癌CNE2细胞后,细胞内BHRF1 mRNA表达量(2.02±0.53),对照转染前明显下调,明显下调,与对照组的(29.82±0.64)比较,差异有显著性意义(P<0.01);DDP和8G放疗作用24 h以后,被转染的细胞的中的蛋白表达大大降低(P<0.05),癌细胞凋亡率上升,明显比对照组癌细胞的凋亡率高(P<0.05)。结论利用RNA干扰技术对人鼻咽癌治疗具有潜在应用价值,BHRF1 shRNA质粒载体不仅仅能调控细胞基因的表达,而且还能够提高癌细胞对顺铂的敏感性。

EB病毒BHRF1基因及其抑制细胞凋亡功能

BHRF1是EBV基因组中具有抑制细胞凋亡功能的基因片段，属Bcl-2基因家族，本文阐述了BHRFI基因及其蛋白产物的特征、表达和抑制凋亡功能，对其在EB病毒致病机理的认识及有关疾病的防治等方面的重大意义进行了分析。

EB病毒BHRF1基因表达对鼻咽癌细胞增殖周期影响的研究

目的：了解ＥＢ病毒编码ＢＨＲＦ１基因表达对鼻咽癌细胞增殖周期的影响。方法：本研究通过构建ＢＨＲＦ１高表达载体并将其转入鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２细胞中，检测转染后稳定表达ＢＨＲＦ１癌细胞的增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）表达和喜树碱作用前后细胞周期分布的改变。结果：ＢＨＲＦ１的表达可促使癌细胞的ＰＣＮＡ表达下降，Ｇ１期细胞增多，Ｓ期细胞减少；而在喜树碱作用后，ＢＨＲＦ１－ＣＮＥ２细胞的凋亡率明显小于对照组，其Ｇ１期细胞数下降，Ｓ期细胞数升高。结论：ＢＨＲＦ１基因的表达可通过调节细胞周期分布、抑制细胞凋亡的发生以增强细胞的生存能力。

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染+丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义(F=6 250.510,q=56.992、51.613,P<0.01)。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。

EB病毒早期基因BHRF1—Bcl-2的病毒性同源基因

BHRF1是近年来得到确认的EBV新的致癌基因,在结构上和功能上与细胞原癌基因Bcl-2相似,属Bcl-2家族成员。由于其抑制细胞凋亡和细胞转化作用而受到广泛关注,本文就BHRF1的作用特点、与bcl-2的关系以及应用前景作一综述。

BHRF1表达对^(60)Co照射后CNE2细胞周期分布的影响

目的：了解ＢＨＲＦ１基因表达对６０Ｃｏ照射后ＣＮＥ２细胞周期分布的影响。方法：构建ＢＨＲＦ１高表达载体并转入ＣＮＥ２细胞中，通过检测癌细胞增殖细胞核抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）表达和在６０Ｃｏ照射后不同时期细胞周期分布的改变。结果：ＢＨＲＦ１可抑制细胞ＰＣＮＡ的表达及降低Ｓ期的百分率；经６０Ｃｏ照射后，ＢＨＲＦ１ＣＮＥ２细胞的凋亡率较低（Ｐ＜００１），Ｓ期细胞数下降不明显（Ｐ＞００５）；在辐射后的２４小时到７２小时，其Ｓ期和Ｇ２期细胞百分率先后升高。结论：ＢＨＲＦ１基因的表达可抑制细胞的增殖并增强其抵抗辐射诱发的细胞凋亡的发生。

APOPTOSIS-RESISTANT DIFFERENCE BETWEEN EBV-BHRF1 GENE POSITIVE AND NEGATIVE CELL LINES AGAINST 3 KINDS OF APOPTOSIS INDUCING FACTORS

Objective: To study the apoptosis-resistant difference between EBV-BHRF1 gene positive and negative cell lines against 3 kinds of apoptosis inducing factors. Methods: These cell lines were cultured in (1) the absence of fetal calf serum (FCS) for 48 h, (2) 43°C for 10 min, and (3) 2×10?6 mol/L dexamethasone for 24 h. Polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), and apoptosis inducing and detecting methods were used. Results: EBV-BHRF1 gene fragment was amplified from B95–8, Raji and SUNE-1 cell lines with PCR technique, while K562 and YAC cell lines were negative. The results against 3 kinds of apoptosis inducing factors from electron microscopy and agarose gel electrophoresis indicated that apoptosis appeared in BHRF1 gene-negative cell lines while apoptosis were normal in BHRF1 gene-positive cell lines. Conclusion: EBV-BHRF1 gene is one of the important factors in suppressing its host cell's apoptosis.