云南药用野生稻BIBAC文库的构建及分析

云南药用野生稻具有许多优良性状和有利基因,其CC基因组的优良基因很难通过有性杂交转移到栽培稻(AA基因组)上,但可以通过双元细菌人工染色体(BIBAC)以大片段的形式转化到栽培稻中。利用BIBAC2载体构建了云南药用野生稻基因组DNA文库,该文库包含53 760个克隆,平均插入片段76 kb,保存在140块384孔板中,其库容相当于药用野生稻基因组的5.86倍。

云南药用野生稻BIBAC文库混合克隆池制备及筛选

在已构建完成的云南药用野生稻BIBAC(binary bacterial artificial chomosome)文库的基础上,将文库制备成一、二、三级混合克隆池,各级混合池的数量分别为3 360、140和14个。根据Xa21抗病基因序列设计1对特异引物,利用4步PCR法对文库混合克隆池进行逐级筛选,初步确定了3个抗病基因阳性克隆。为今后以PCR法高效利用云南药用野生稻BIBAC文库挖掘其优异基因奠定了良好的基础。

高效制备双元细菌人工染色体(BIBAC)载体DNA的研究

高质量的BIBAC载体DNA的制备受到酶切、脱磷等许多因素的影响,是构建BIBAC文库的关键步骤之一.以BIBAC2载体为材料,对其进行了BamHI限制性酶切和CIAP脱磷,制备了可用于进一步构建文库的线性载体.在此基础上确定了适宜的酶量、酶切时间、脱磷酶的用量及失活等步骤的反应条件.

耐盐芦苇大片段BIBAC载体构建及水稻遗传转化

利用盐生植物的耐盐基因改良作物耐盐性是保障土壤盐渍化地区粮食生产和改良盐渍化土地的最经济最有效的途径。本研究以生长于西北盐盖上的一种耐盐野生芦苇为材料,制备了Mb级耐盐芦苇基因组DNA,酶切后经脉冲场凝胶电泳将其分离为不同大小的大片段DNA区段,并与酶切回收的BIBAC-S载体进行连接,成功构建了耐盐芦苇不同大小的大片段DNA-BIBAC载体,经根癌农杆菌EHA105介导,成功地转化了粳稻品种‘中花11’成熟胚愈伤组织,获得了转基因水稻植株。研究表明,不同大小的大片段DNA-BIBAC载体在转化同一受体材料时,其所获得的愈伤转化率、植株转化率、转基因植株的阳性率等存在差异,说明插入片段的大小与转化效率之间存在关系。本研究为创制耐盐水稻新种质、克隆盐生植物的耐盐基因提供了理论和技术参考。

BIBAC2载体转化水稻的研究

双元细菌人工染色体（BIBAC）栽体具有克隆大片段DNA构建文库和农杆菌介导转化植物的双重功能．利用BIBAC载体，在双子叶植物烟草和番茄中已实现了大片段DNA的转移，但在单子叶植物中的应用还未见报道．本研究利用不同水稻基因型、不同农杆菌菌株，对水稻进行了BIBAC2栽体的转化研究．水稻成熟胚诱导愈伤组织经过1～2次继代培养，在含乙酰丁香酮的N6培养基上预培养3d，在含BIBAC2栽体的农杆菌中侵染10min，26℃下共培养3d．感染后的愈伤组织在含25～50mg／L潮霉素培养基上经过4～8周的筛选，共得到了66株抗性再生植株．通过对抗性植株中GUs基因的组织化学染色检测，NPTⅡ基因的PCR检测和ELISA检测，HYG基因的PCR检测，确认2株阳性植株来自EHA105菌系侵染的中花15号愈伤组织，1株阳性植株来自EHA105菌系侵染的中花8号愈伤组织，转化率分别为2．9％和0．9％．结果表明，B1BAC2栽体已被成功导入了水稻基因组中，转化效果EHA105菌株优于C58C1菌株，中花15号、中花8号优于中花10号和中花11号．结果还表明，利用三亲交配法可以将大于23．5kb的载体转化到农杆菌中．初步建立了BIBAC2栽体转化水稻的技术体系，为利用BIBAC系统向水稻转入大片段DNA和多个外源功能基因奠定了基础．

基于BIBAC文库的芦苇高分子量核DNA的制备方法

获得高质量的高分子量核DNA(HMW-DNA)是大片段DNA插入BIBAC载体的重要前提。为避免多酚等次生代谢物质对DNA的污染,前人研究多以黄化苗为材料。本研究对传统的Zhang等(1995)方法进行改良,以野生耐盐芦苇(Phragmites australis Trin.)的成熟叶片为材料,成功制备了高质量的芦苇高分子量核DNA(HMW-DNA)。改良Zhang法适合野生耐盐芦苇HMW-DNA的提取,提取过程更加温和,得到的细胞核相对纯净、完整度较高,后续蛋白酶K消化效果好,便于酶切。脉冲场凝胶电泳显示,本研究方法所制备的野生芦苇HMW-DNA的分子量大于1 Mb,经Bam HⅠ酶切后可获得较多的100~200 kb大片段DNA。因此,野生耐盐芦苇高分子量DNA质量完全满足芦苇BIBAC文库构建的要求。

野生稻细胞核DNA提取的研究

药用野生稻是中国最具利用价值的野生稻资源之一,具有许多优良的性状和有利基因,是改良栽培稻培育新品种的宝贵基因库,而其CC基因组的优良基因有望以大片段形式通过B IBAC等载体转化到栽培稻中。B IBAC文库不仅能作为大片段基因组文库的载体,而且能通过根癌农杆菌介导将克隆片段导入植物基因组直接进行转化,可用于筛选分离基因等研究。如何获得基因组DNA大片段非常关键,本研究采取琼脂糖包埋基因组的方法获得大片段DNA,并对其中的一些步骤进行了优化,为构建药用野生稻B IBAC文库打下了很好的基础,值得在其它植物类似研究中参考。

大片段DNA克隆载体的研究进展

DNA克隆技术是分子生物学和基因工程研究中非常重要的一项技术。自第一个质粒载体pSC101作为第一个克隆载体以来,随着分子生物学技术的迅猛发展克隆载体的整体结构、容载能力和转化效率都有了很大的改善。通过综述克隆载体的发展概况,以及大片段DNA文库的构建和应用,对大片段DNA遗传转化的发展做了展望。

胡杨大片段转化拟南芥植株表型分析

胡杨是研究林木对极端逆境响应的首选材料。开展胡杨随机插入大片段遗传转化,克服了单基因对植物表型的微效应而不易检测的难题,是植物基因功能研究思路的新尝试。用花序浸染法将胡杨基因大片段转化到拟南芥中,筛选出有特异性状并稳定表达的转化型植株。表型分析结果表明,转化型拟南芥植株与野生型的生长性状存在明显差异,与野生型相比,转化型种子粒径增长达14%、千粒重增加达27%,这为进一步开展该基因大片段功能研究,奠定了前期实验基础。

水稻双元细菌人工染色体载体系统转化体系的建立(英文)

普通双元载体已被广泛应用于农杆菌介导的植物转化,但这类载体通常只能转移5-20 kb的外源DNA片段;而双元细菌人工染色体(BIBAC)载体可以弥补普通双元载体的不足,通过它已在烟草、番茄等双子叶植物中实现了大片段 DNA(150 kb)的转移。BIBAC载体在单子叶植物转化中的应用尚未见报道。由于单、双子叶植物间以及大、小片段转化间的转化体系存在明显差异,常规的农杆菌介导的水稻转化体系不能适应BIBAC系统转化的要求。因此,建立适于BIBAC 系统的水稻转化体系是十分必要的。通过比较不同的受体材料,不同的预培养、共培养条件,不同的去除农杆菌及选择阳性愈伤的方式等对转化效率的影响,建立了适合水稻BIBAC系统的转化体系。该体系的技术要点包括:以水稻品种H1493 为转化受体;以含毒性辅助质粒pCH32的LBA4404菌株(HP4404)为侵染菌株;预培养的培养基pH5．6;以N6A代替AAM 悬浮农杆菌:侵染菌液浓度为OD600=1．0;共培养温度为24℃;采用过渡(Resting)培养除去农杆菌;采用二步法进行选择等。基于PCR检测、Southern印迹分析的结果表明,BIBAC载体所携带的插入片段及标记基因已整合到转化植株的基因组中。这个体系的建立为在水稻中利用BIBAC系统进行大片段DNA转化奠定基础。

毛竹大片段双元细菌人工染色体基因组文库的构建

从毛竹Phyllostachys pubescens幼嫩叶片中提取纯化得到高质量的基因组DNA,经限制性内切酶BamH I对它们进行梯度酶切,脉冲场电泳选择合适酶切DNA片段,与脱磷酸化处理过的质粒载体pCLD04541按质量比3∶1相互连接,转化大肠杆菌Escherichia coli DH10B感受态细胞进行蓝白斑筛选,挑取白色克隆,获得重组率较高的阳性克隆,构建了含有104个克隆的双元细菌人工染色体(BIBAC)基因组文库,并通过脉冲场电泳检测分析后确定,所构建的毛竹BIBAC文库平均插入片段为105 kb,约覆盖5倍毛竹基因组。该文库的构建为毛竹基因组研究做好了前期的基础工作。

可转化大片段DNA载体系统及其在花生育种中的应用前景

可转化大片段DNA载体系统主要包括双元细菌人工染色体BIBAC(binary bacterial artificial chromosome)和可转化人工染色体TAC(transformation-competent artificial chromosome)系统,它们能够高效克隆大片段DNA,在获取目的基因相关信息的同时转化植物得到转基因植株。综述了BIBAC和TAC载体的特点、种类、发展现状以及近年来在植物种质创新中的应用。根据我国花生育种的现状,展望了可转化大片段DNA载体系统在利用野生花生资源改良栽培花生品种中的应用前景。