BIX-01294对Molt-4细胞增殖、凋亡及组蛋白甲基化的影响

目的观察甲基化转移酶G9a抑制剂BIX-01294对急性T淋巴细胞白血病Molt-4细胞增殖、凋亡及组蛋白甲基化的影响。方法 MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax、抑癌蛋白P15、DNA去甲基化酶DNMT1、组蛋白H3乙酰化、组蛋白H3K9单、双、三甲基化水平,H3K27单甲基化、双甲基化水平的变化。结果 BIX-01294可下调Bcl-2蛋白、上调Bax蛋白的表达,Caspase-3表达上调,诱导细胞凋亡,浓度为0、1、2、4μmol·L-1的BIX-01294作用Molt-4细胞24 h后,凋亡率分别为(5.54±1.35)%、(10.24±2.26)%、(32.28±3.26)%、(47.52±4.37)%(P<0.05),差异有统计学意义。BIX-01294抑制DNMT1表达,上调P15蛋白表达,抑制细胞的增殖;BIX-01294下调组蛋白H3K9、H3K27单甲基化和二甲基化水平,而组蛋白H3乙酰化及H3K9三甲基化水平无明显改变。结论 BIX-01294通过抑制G9a的活性,下调H3K9、H3K27单甲基化、二甲基化水平,抑制DNMT1,使上调P15蛋白,最终抑制Molt-4细胞增殖,并诱导细胞凋亡。

BIX-01294靶向组蛋白甲基转移酶G9a在小细胞肺癌患者中的应用研究

目的 探讨BIX-01294靶向组蛋白甲基转移酶G9a在小细胞肺癌患者中的应用。方法选择2016年2~8月医院收治的小细胞肺癌患者50例,患者均行手术治疗,取小细胞肺癌病灶标本及相应癌旁正常组织标本,采用HE染色及免疫组化染色检测两种不同标本中BIX-01294靶向组蛋白甲基转移酶G9a表达情况。结果50例小细胞肺癌患者中,29例发生淋巴或远处转移,21例未发生转移。50例肿瘤相应癌旁3 cm以上的肺组织均为正常组织。G9a抑制剂BIX-01294在两种组织阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05);小细胞肺癌G9a抑制剂BIX-01294表达水平与临床分期、肿瘤分级关系密切(P<0.05);G9a抑制剂BIX-01294在小细胞肺癌癌旁组织及小细胞肺癌中均有表达,主要集中在细胞质中,细胞膜及细胞核中也有表达,免疫组化颗粒呈棕黄色。小细胞肺癌组织中29份标本呈阳性表达,50例癌旁组织中,14例阳性表达。结论G9a抑制剂BIX-01294在小细胞肺癌组织中表达上调,能调控小细胞肺癌患者Wnt信号通路。

BIX-01294对山羊胎儿成纤维细胞生长状态和组蛋白H3K9二甲基化的影响

为探讨BIX-01294对供核细胞的影响,使用不同浓度的BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、H3K9me2水平和多能性基因的mRNA水平。细胞活力检测结果显示,BIX-01294浓度在1.0μmol/L以下不会影响细胞活力,2.0μmol/L时24h和48h处理组的细胞活力显著下降(P<0.05),≥4.0μmol/L时所有处理组的细胞活力均极显著下降(P<0.01)。细胞周期和凋亡检测结果显示,H3K9me2下调会引起细胞周期的停滞和正常细胞的减少,其中BIX-01294在大于2.0μmol/L时G0/G1期细胞的比例极显著升高(P<0.01),4.0μmol/L时凋亡细胞极显著增加(P<0.01)。处理后的细胞H3K9me2水平均极显著下降(P<0.01),但大于1.0μmol/L的处理浓度能获得较好的下调效果。处理后细胞Oct4、Sox2和Nanog的mRNA水平均有不同程度的增加,其中Oct4和Nanog的mRNA水平增加极显著(P<0.01)。说明:采用1.0μmol/L BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞,可以下调H3K9me2水平,增加G1/G0期细胞比例,上调细胞多能性基因表达量,而且不影响细胞活力。

BIX-01294对肝癌细胞增殖能力的影响

目的哺乳动物细胞中H3K9的甲基化是引起基因表达抑制的主要修饰标记之一,H3K9的二甲基化在维持肿瘤细胞自我复制方面所起的作用仍不清楚。本研究将探讨组蛋白甲基化转移酶G9a抑制剂BIX-01294对肝癌细胞增殖的影响及其作用机制。方法将肝癌细胞HepG2和Huh7分为BIX-01294处理组和空白对照组,用5μmol/L的BIX-01294分别处理24、48和72h。CCK-8法检测BIX-01294对肝癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测对细胞周期的影响;蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白CyclinB1、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p27、组蛋白H3及组蛋白H3K9二甲基化(H3K9me2)水平的变化。结果随着作用时间的延长,5μmol/L的BIX-01294对肝癌细胞有抑制增殖作用,且具有时间依赖性;在处理肝癌细胞24、48和72h后,HepG2细胞的存活率分别为95.27%、92.19%和53.94%,F=76.058,P<0.001;Huh7细胞的存活率分别为93.11%、86.12%和47.72%,F=99.832,P<0.001。流式细胞术检测结果表明,BIX-01294处理组肝癌细胞发生G0/G1阻滞,且阻滞呈时间依赖性。分别处理24、48和72h时,HepG2细胞G0/G1细胞比例分别为(70.55±1.38)%、(72.27±0.59)%和(79.63±3.40)%,F=19.937,P<0.001;Huh7细胞G0/G1细胞比例分别为(72.34±0.60)%、(80.36±0.78)%和(79.77±1.01)%,F=256.060,P<0.001。蛋白质印迹法检测结果显示,与对照组相比,组蛋白H3表达无显著改变,G9a、组蛋白H3K9二甲基化(H3K9me2)水平及细胞周期相关蛋白CyclinB1表达显著降低,细胞周期依赖激酶抑制因子p27的表达显著上调。结论 BIX-01294通过抑制G9a的活性,下调H3K9me2水平,从而抑制肝癌细胞HepG2及Huh7的增殖,促进G0/G1的周期阻滞,其机制可能与上调细胞周期依赖激酶抑制剂p27,以及下调细胞周期相关蛋白CyclinB1表达有关。

BIX-01294对肝癌细胞周期、凋亡及移植瘤的影响

目的:探究组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂(BIX-01294)对肝癌细胞周期、凋亡及移植瘤的影响。方法:将SMMC-7721、BEL-7402、HL-7702原始细胞株传代培养后,分为空白对照组和不同浓度(1μM、5μM、10μM、20μM)BIX-01294处理组。应用Western-blot法检测G9a及肝癌细胞内凋亡蛋白CC3、C-PARP、Bax、Bcl-2表达水平;应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度BIX-01294处理SMMC-7721、BEL-7402细胞24、48、72、96 h后的细胞增殖情况;应用流式细胞术检测不同浓度的BIX-01294处理肝癌细胞96h后细胞周期分布情况;移植瘤试验21 d后测量裸鼠体内肿瘤体积及重量,并检测瘤体内H3K9me2的蛋白水平。结果:G9a在肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7402中表达水平高于HL-7702细胞(P<0.05)。不同浓度的BIX-01294对SMMC-7721细胞和BEL-7402细胞增殖具有抑制作用,且具有时间依赖性和剂量依赖性(均P<0.05)。不同浓度BIX-01294处理细胞96h后,SMMC-7721细胞和BEL-7402细胞G0/G1期细胞比例增加,S和G_(2)/M期的细胞比例降低(P<0.05)。5μM BIX-01294处理细胞96h后能明显增加CC3、Bax、C-PARP表达水平,并降低Bcl-2的表达水平(P<0.05),与空白对照组相比,BIX-01294处理组裸鼠肿瘤体积减小,重量较低,且肿瘤组织内H3K9me2的表达水平下降(P<0.05)。结论:BIX-01294导致SMMC-7721、BEL-7402细胞发生周期阻滞和凋亡,且对肿瘤的生长具有明显的抑制作用,其可能是通过抑制G9a的表达从而降低H3K9me2的表达来抑制肿瘤的生长。

BIX-01294通过诱导DNA损伤和激活线粒体凋亡途径抑制食管鳞癌细胞增殖

目的探讨组蛋白甲基化酶G9a抑制剂BIX-01294诱导食管鳞癌细胞凋亡的作用效应和分子机制。方法 MTT和集落形成实验分析BIX-01294对食管鳞癌细胞EC109和KYSE150生长、增殖的影响;流式细胞术分析BIX-01294作用后细胞的凋亡情况;免疫印迹实验检测BIX-01294作用后G9a催化产物H3K9me2、DNA双链断裂标记和细胞凋亡相关蛋白表达的变化。结果 BIX-01294呈剂量依赖关系抑制EC109和KYSE150细胞的生长(P<0.05),半数抑制率(IC50)剂量作用细胞显著抑制集落克隆的形成(P<0.05)。BIX-01294(IC50)作用24 h,EC109细胞凋亡率由11.5%±2.1%上升至42.5%±5.4%,KYSE150细胞凋亡率由7.5%±0.9%上升至49.2%±5.2%,差异有统计学意义(P<0.05);G9a催化产物H3K9me2表达下降(P<0.05);DNA双链断裂标记蛋白γH2AX的表达显著上调(P<0.05);线粒体凋亡途径被激活,cleaved caspase3和cleaved PARP的表达显著上调(P<0.05)。结论组蛋白甲基化酶G9a抑制剂BIX-01294通过诱导DNA双链断裂损伤和激活线粒体凋亡途径诱导食管鳞癌细胞的凋亡。

G9a表达抑制对骨肉瘤细胞MG-63增殖的影响

目的:探讨组蛋白甲基转移酶G9a在骨肉瘤中的表达以及靶向抑制G9a活性对于骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:采用RT-PCR检测骨肉瘤组织及正常毗邻组织中G9a的表达情况,同时检测骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞中G9a的表达。通过MTT及克隆形成试验检测G9a抑制剂BIX-01294对MG-63细胞增殖的影响。结果:G9a在肿瘤组织中表达明显高于正常组织(P<0.05),且在肿瘤细胞系MG-63及U-2OS中的表达也高于正常成骨细胞系hFOB1.19(P<0.05)。BIX-01294能够显著抑制MG-63细胞的增殖(P<0.05),而对正常成骨细胞系hFOB1.19的增殖却无明显影响(P>0.05)。结论:G9a在骨肉瘤中高表达,靶向抑制G9a的功能可以抑制肿瘤细胞的增殖,G9a为未来治疗骨肉瘤的潜在靶点。

靶向抑制组蛋白甲基转移酶G9a通过线粒体凋亡途径抑制肺腺癌细胞增殖

目的探讨小分子抑制剂BIX-01294靶向组蛋白甲基转移酶G9a抑制肺腺癌细胞增殖的作用及分子机制。方法应用四甲基偶氮唑蓝法和集落克隆实验检测BIX-01294对人肺腺癌细胞A549生长、增殖的影响，应用流式细胞术检测BIX-01294干预对细胞凋亡的影响，应用Western blot检测13IX-01294干预后，G9a催化产物H3K9me和H3K9me2以及细胞凋亡相关蛋白的表达。研究easpases抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞后，BIX-01294抑制A549细胞增殖是否呈凋亡依赖性。结果与空白对照组比较，组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂BIX-01294抑制A549细胞的生长，呈剂量时间依赖关系。BIX-01294作用7d，空白对照组和10μmol／LBIX-01294组的集落形成数分别为（172．7±23．0）个和（42．5±8．7）个，差异有统计学意义（P〈0．05）。10μmol／LBIX-01294作用24h，A549细胞凋亡率为（47．6±8．4）％，与空白对照组[（7．2±3．6）％]比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。10μmol／LBIX-01294干预24h，A549细胞中C9a催化产物H3K9me和H3K9me2的表达下降，线粒体凋亡途径蛋白Bax、Bak和cleaved caspase-9的表达上调，抗凋亡蛋白Bel-2的表达下降，死亡受体凋亡途径蛋白cleaved caspase-8的表达无变化，凋亡执行蛋白cleaved caspase-3和cleavedPARP的表达上调。Z-VAD-FMK预处理后，A549细胞中凋亡率和凋亡相关蛋白的表达下降。结论BIX-01294具有抑制肺腺癌细胞增殖的作用，激活线粒体途径诱导细胞凋亡是其抗肿瘤作用机制之一。

组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂联合索拉菲尼对肾癌细胞增殖能力的影响

目的 G9a作为组蛋白甲基化转移酶,探究其特异性抑制剂 BIX-01294与经典抗癌药物索拉菲尼联合使用对于肾癌细胞增殖能力的影响。方法 BIX-01294与索拉菲尼各单独或联合作用于A498肾癌细胞时,通过实时荧光定量和蛋白免疫印记法检测G9a的mRNA和蛋白的表达水平,蛋白免疫印记法检测G9a蛋白以及其下游基因H3K9me2的蛋白表达水平,克隆形成实验测定A498细胞的增殖能力,流式细胞术法检测A498细胞的凋亡情况。结果 BIX-01294与索拉菲尼单独使用以及联合用药都能引起G9a蛋白表达水平的下调,同时引起A498细胞增殖能力降低,凋亡水平上调,两者联合使用效果更加明显。结论 BIX-01294 以及索拉菲尼均可引起肾癌细胞G9a mRNA以及蛋白的表达水平下调,两种药物联合使用效果最好,可明显降低细胞的增殖能力,同时细胞凋亡程度更为明显,为肾癌患者的化疗治疗、用药方法以及后续的机制研究提供了全新的参考。