真核表达重组小鼠IL-15/Fc融合蛋白的制备和活性鉴定

目的制备真核表达小鼠白细胞介素15(IL-15)和IgGγ1Fc段融合蛋白,并探讨其对抗原特异性CD8+T细胞的作用。方法运用RT-PCR方法,从B6小鼠脾细胞中分离小鼠IL-15和IgGγ1绞链区-CH2-CH3Fc cDNA。在IL-153′端和Fc5′端引入BamHI酶切位点,将IL-15和Fc直接连接,构建小鼠IL-15/Fc融合蛋白基因,再连接到真核表达质粒载体pcDNA3.1(a+)上,转化CHO-S细胞表达、纯化后,研究其活性。结果融合蛋白486bp的编码由162个氨基酸组成,其中含48个信号肽氨基酸的小鼠IL-15前体蛋白和由681bp编码227个氨基酸的IgGγ1-CH2-CH3功能区构成;表达蛋白在IL-15信号肽引导下能高效分泌到培养液中,有二聚体和三聚体两种天然结构,单体分子量约50kDa,能特异性的结合IL-15R并抑制抗原诱导的CD8+T细胞的增殖反应。结论成功构建了小鼠IL-15/Fc融合蛋白真核表达载体,并在CHO-S细胞中得到高效表达。此融合蛋白具有较高的生物学活性,可有效地抑制抗原特异性CD8+T细胞的增殖反应。

补肾促卵颗粒对体外受精周期颗粒细胞骨形成蛋白-15蛋白表达的影响

目的:观察补肾促卵颗粒对IVF周期颗粒细胞骨形成蛋白-15(bone morphogenetic protein-15,BMP-15)的影响,探讨提高妊娠率的可能机制。方法:将因输卵管因素行体外授精-胚胎移植(IVF-ET)82例患者随机分为治疗组(IVF治疗周期加用补肾促卵颗粒)42例,对照组(IVF治疗周期加用安慰剂颗粒)40例。观察临床肾虚证候积分变化情况,促性腺激素(Gn)用量及用药天数,取卵数、优质卵率、受精率、优质胚胎率、临床妊娠率及颗粒细胞BMP-15蛋白表达情况。结果:治疗组患者肾虚症状得到明显改善,治疗组Gn用量及用药天数低于对照组,优质卵率、优质胚胎率及临床妊娠率均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);颗粒细胞BMP-15蛋白表达都优于对照组。结论:补肾促卵颗粒改善了卵母细胞成熟度,提高胚胎质量及临床妊娠率,可能与通过提高颗粒细胞BMP-15蛋白的表达有关。

卵巢粒层细胞瘤与纤维卵泡膜细胞瘤蛋白质组学研究

目的:卵巢粒层细胞瘤(ovary granulosa cell tumor,OGCT)与纤维卵泡膜细胞瘤(ovarian fibrothecoma,OF)是卵巢性索间质肿瘤较为常见的类型。由于二者均含有卵泡膜细胞且OGCT呈弥漫性生长模式时与富于细胞的OF和黄素化的OF组织学形态具有相似性,造成二者在病理诊断过程中鉴别困难。本文旨在通过探究OGCT与OF蛋白质组学差异、筛选二者间差异表达蛋白质(differentially expressed proteins,DEPs),发现鉴别诊断二者的生物学标志物。方法:选取5例OGCT和5例OF患者的新鲜肿瘤样本组织,采用蛋白质消化、肽段纯化技术及液相色谱-质谱/质谱分析进行蛋白质定量。运用软件对OGCT和OF的蛋白质进行DEPs分析;对DEPs进行基因本体(gene ontology,GO)和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,并在生物过程(bioprocess,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组分(cell component,CC)方面对蛋白质/基因进行功能注释,探讨DEPs显著富集的信号通路;通过检索基因/蛋白质相互作用(search tool for the retrieval of interacting genes/proteins,STRING)数据库获得筛选出的DEPs相互作用信息,构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。选取26例OGCT和28例OF石蜡包埋组织,通过组织芯片技术和免疫组织化学染色法验证筛选出的DEPs在OGCT和OF中的表达情况。结果:共筛选出24个OGCT与OF显著DEPs,其中13个蛋白质在OGCT中表达量显著上调,11个蛋白质在OF中表达量显著上调。GO富集分析结果显示:富集到BP上的通路包括细胞外基质(extracellular matrix,ECM)处理过程,细胞外结构组织,有机酸、羧酸、脂肪酸和单羧酸分解代谢过程;富集到CC上的通路包括含胶原蛋白的ECM、内质网腔和线粒体基质;富集到MF上的通路包括硫化物结合、ECM结构成分、酰胺结合、胶原结合、转移酶活性和转移酰基。KEGG富集分析结果显示:上调的DEPs主要富集于缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解途径;下调的DEPs主要富集于先天性谷胱甘肽代谢缺陷症、朊病毒疾病、花生四烯酸代谢途径、补体系统、细胞色素P450对异种生物的代谢作用和药物代谢-细胞色素P450。PPI结果显示24个DEPs与多种蛋白质存在相互作用关系。组织芯片免疫组织化学染色显示:PLOD3在OGCT中高表达,在OF中低表达,与富集分析结果一致。结论:通过蛋白质组学技术和生物信息学分析方法共筛选出24个DEPs,经免疫组织化学验证,PLOD3在OGCT与OF鉴别诊断中具有一定的临床应用价值,有望成为OGCT与OF鉴别诊断的生物学标志物。

梅花鹿激活素A重组蛋白真核表达、纯化及其生物活性的测定

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。

黄体生成素干预大鼠卵巢颗粒细胞的蛋白质组学分析

目的分析黄体生成素(luteinizing hormone,LH)干预卵巢颗粒细胞后差异蛋白的表达,探讨LH对颗粒细胞作用中重要蛋白及其生物学功能。方法体外分离培养大鼠原代卵巢颗粒细胞,给予LH处理3 h为实验组,生理盐水处理作为对照组。通过液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)联用法得到蛋白样品二级质谱,利用质谱数据库筛选显著差异表达蛋白,对差异表达蛋白进行生物信息学分析,并通过Western blot对部分差异蛋白进行验证。结果与对照组相比,LH干预组共有57个蛋白表达有显著差异,其中25个上调,32个下调;生物信息学分析显示多数差异蛋白具有结合活性和催化活性,主要富集于酶代谢过程中及参与调控细胞代谢过程;Western blot验证发现调控细胞增殖与极性的蛋白Pard3、Mark3表达上调,抗氧化应激蛋白Gstp1和Nqo1的表达量下调,与蛋白质组学结果一致。结论LH可引起卵巢颗粒细胞多种差异蛋白表达,影响颗粒细胞间的结合方式、激素合成能力、氧化应激及细胞周期和增殖等功能,且差异蛋白涉及多条相关细胞信号通路传导,提示LH从多方面影响卵巢颗粒细胞的功能。

多囊卵巢综合征患者颗粒细胞蛋白质组学分析

目的应用定量蛋白质组学方法分析多囊卵巢综合征(PCOS)患者颗粒细胞蛋白质表达变化。方法收集2020年9月至2021年9月于我院生殖医学中心行IVF/ICSI助孕的患者取卵后废弃卵泡液标本24例,其中PCOS组12例和正常排卵对照组12例,从中提取颗粒细胞。采用液相色谱-串联质谱方法得到其蛋白质表达谱,生物信息学分析鉴定差异表达蛋白及其功能。采用Western Blot法验证质谱结果。结果共鉴定出329种差异表达蛋白,其中上调蛋白169个,下调蛋白160个。KEGG富集分析结果显示,差异蛋白在亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸分解,糖酵解/糖异生,谷胱甘肽代谢等通路显著富集。结论PCOS女性与正常排卵女性之间颗粒细胞蛋白质表达谱存在显著差异,进一步探索差异蛋白的功能或许可以为PCOS发病机制的研究提供线索。

中药补肾调经方对体外受精-胚胎移植超排卵周期妊娠结局及骨形成蛋白(BMP)-15的影响

目的:探讨中药补肾调经方对提高IVF-ET超排卵周期所获卵和胚胎质量的作用及其机制。方法:将70例因输卵管因素行IVF-ET的患者随机分为中药+控制性超排卵(实验组,n=35)和单纯控制性超排卵组(对照组,n=35),应用Western blotting法测定取卵日成熟卵泡卵泡液中骨形成蛋白-15(bone morphogenetic protein-15,BMP-15)的含量;用RT-PCR法检测颗粒细胞中BMP-15 mRNA的表达;并比较组间的获卵数、受精率、优质胚胎率及妊娠率等。结果:实验组卵泡液中BMP-15mRNA水平及颗粒细胞中BMP-15 mRNA的表达均显著高于对照组(P<0.05);实验组的临床妊娠率(71.42%)显著高于对照组(48.57%)(P<0.05)。结论:补肾调经方可以提高IVF-ET妊娠率,其作用机制可能与调控卵泡液和颗粒细胞BMP-15水平有关。

骨形态蛋白(BMP)-15对子宫内膜异位症患者IVF结局影响的临床研究

目的:探索卵丘颗粒细胞早期凋亡和骨形态蛋白-15(bone morphogenetic protein-15,BMP-15)对子宫内膜异位症(EMs)患者IVF结局的影响。方法:行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的不孕患者,根据不孕指征分为EMs组及对照组。分别记录患者一般情况、获卵数、正常受精卵数、卵裂数、优质胚胎数、胚胎种植数和临床妊娠率。流式细胞仪测定所有对象卵丘颗粒细胞的早期凋亡率,Western blotting检测卵泡液中BMP-15蛋白的表达量。结果:获卵率、受精率、卵裂率、优质胚胎率差异无统计学意义(P>0.05);EMs组与对照组相比,获卵数分别为8.2±5.7个和12.0±5.8个,着床率分别为29.73%和47.31%,临床妊娠率分别43.37%和69.32%,差异均有统计学意义(P<0.05)。EMs组卵丘颗粒细胞的早期凋亡率为37.82±15.81%,对照组为8.85±5.58%,差异具有统计学意义(P<0.01)。卵泡液中BMP-15蛋白相对表达量EMs组为0.67±0.18,对照组0.94±0.33,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:EMs患者IVF着床率及临床妊娠率降低,可能与卵母细胞分泌较少的BMP-15、颗粒细胞早期凋亡率增加,影响卵母细胞质量和胚胎的正常发育有关。

猪bmp15基因报告载体的构建及其特异性

为了研究骨形态发生蛋白15(bmp15)基因的表达和调控特性,通过克隆猪bmp15基因2.2 kb启动子片段,构建pBMP15-EGFP报告载体,实现监测干细胞向类卵母细胞分化的过程。以猪卵巢组织和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、成肌细胞(C2C12)、猪羊水干细胞(pAFSC)为材料,通过RT-PCR、免疫荧光、细胞转染、显微注射检测bmp15组织特异性表达,并且通过单层细胞诱导检测该基因体外示踪类卵母细胞获得过程的能力。RT-PCR结果显示bmp15在猪的卵巢组织中特异表达,在CHO中表达,而在C2C12和pAFSC中不表达。卵巢组织切片免疫荧光检测结果显示bmp15表达于卵泡发育的各个阶段。瞬时转染不同细胞发现启动子只在CHO中有活性,而在C2C12和pAFSC中均无活性。显微注射重组质粒片段结果显示增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein,EGFP)在卵母细胞体外成熟18 h启动表达,并能够持续至4-细胞期胚胎。单层细胞诱导结果显示诱导12 d的pAFSC出现携带EGFP的圆形细胞团。说明bmp15具有表达特异性和示踪干细胞诱导分化为类卵母细胞的潜能。