犏牛BMP4基因的克隆、生物信息学分析及在附睾的表达研究

骨形态发生蛋白4(BMP4)基因在哺乳动物生殖机能方面起着重要的调控作用。本研究通过分子克隆技术对犏牛BMP4基因的编码区序列进行克隆,分析BMP4基因的生物信息学特征及其在附睾组织中的表达特点。生物信息学分析结果显示:犏牛BMP4基因CDS区片段长1 371 bp,编码456个氨基酸;BMP4蛋白存在一层跨膜结构,肽链中亲水性氨基酸的数量显著高于疏水性氨基酸,表明具有亲水性;组成犏牛BMP4蛋白的456个氨基酸中,100个氨基酸位于α螺旋区,占氨基酸总数的21.93%,82个氨基酸位于延伸链区,占总数的17.98%,14个氨基酸位于β转角区,占总数的3.07%,260个氨基酸以无规则状态存在,占总数的57.02%;犏牛BMP4氨基酸序列与牦牛、绵羊等物种存在较高的同源性,分别为99.2%和99.3%。qPCR分析结果显示:犏牛BMP4基因在附睾体部的表达显著高于头部和尾部。本研究为进一步探讨犏牛精子成熟机制及BMP4基因在犏牛附睾不同部位的作用机制提供了基础数据。

DACT3激活BMP4/Smad信号通路促进胶质瘤细胞铁死亡

目的探究基因DACT3促进神经胶质瘤细胞(U251、U118)铁死亡的分子机制。方法培养人U251、U118胶质瘤细胞,慢病毒转染构建稳定过表达DACT3的细胞后,qRT-PCR和Western blot检测转染效率。上述细胞分成3组:Ctrl组(对照组)、DACT3组(过表达DACT3细胞组)和DACT3+ferrostatin-1组(过表达DACT3+铁死亡抑制剂)。采用CCK-8检测细胞生存率,铁离子、MDA、谷胱甘肽(glutatione,GSH)检测试剂盒测定细胞铁离子、MDA、GSH含量,Western blot检测GPX4、SLC7A11、TFR1表达。进一步将上述细胞分为以下3组:Ctrl组(对照组)、DACT3组(过表达DACT3细胞组)和DACT3+siBMP4组(过表达DACT3+敲低BMP4组),再次利用CCK-8检测细胞生存率,铁离子、MDA、GSH检测试剂盒测定细胞铁离子、MDA、GSH含量,Western blot检测GPX4、SLC7A11、TFR1、BMP4、p-Smad表达。结果DACT3组中DACT3 mRNA和蛋白表达均显著高于Ctrl组;与Ctrl组比较,DACT3组细胞生存率明显下降,铁离子、MDA含量显著升高,GSH含量明显下降,GPX4、SLC7A11表达显著下降,TFR1、p-Smad、BMP4表达明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05);DACT3+ferrostatin-1组、DACT3+siBMP4组均能一定程度抵消DACT3导致的上述指标的变化,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论DACT3可以促进U251、U118胶质瘤细胞铁死亡,其机制与BMP4/SMAD信号通路激活有关。

BMP4对山羊精原干细胞体外分化的影响

精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是精子发生的基础,对于繁衍后代具有非常重要的作用。目前大家畜SSCs的体外分化体系尚不明确,需要进一步进行深入研究。本研究探究了BMP4作为外源诱导分化因子对山羊精原干细胞体外分化的影响,采用两步酶消化法和2 h~2 h~12 h差速贴壁法提纯山羊SSCs,免疫荧光染色结果显示,纯化后的SSCs能够表达分子Marker CD90和PLZF。RT-PCR结果表明,相较于其它浓度和作用时间,基础培养液中单独添加50 ng/mL BMP4作用24 h能够达到调控SSCs分化的最佳效果(P<0.05)。

BMP4在牦牛和犏牛睾丸组织及支持细胞中的差异表达分析

【目的】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离培养支持细胞,检测骨形态发生蛋白4基因(BMP4)及其受体基因在牦牛、犏牛睾丸组织及支持细胞中的表达情况,为深入研究BMP4对犏牛精子发生过程的作用提供理论基础。【方法】采集12月龄牦牛和犏牛睾丸组织,使用Trizol法提取各睾丸组织总RNA,利用RT-PCR技术检测BMP4及其受体基因(骨形态发生蛋白受体1B型(ALK6)、骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)、激活素A受体2A型(ACVR2A)、激活素A受体2B型(ACVR2B))的mRNA表达水平。通过两步酶法消化睾丸组织制备细胞悬液,经差速贴壁、饥饿处理和胰酶消化分离纯化牦牛和犏牛睾丸支持细胞。采用HE染色、油红O染色、碱性磷酸酶(ALP)染色、免疫荧光染色鉴定支持细胞,用Trizol法提取细胞总RNA,RT-PCR检测支持细胞、生精细胞、间质细胞、类肌细胞标志基因和BMP4及其受体基因的mRNA表达水平。采用实时荧光定量PCR检测BMP4及其受体基因在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中的差异表达情况。【结果】HE染色结果显示,第3代(F3)支持细胞呈长条形或梭形。油红O染色结果显示,体外培养的细胞胞质中有明显脂滴积累,且在细胞核内可观察到支持细胞特有的双极小体结构。ALP染色结果显示,细胞不着色。免疫荧光染色结果显示,支持细胞标志蛋白GATA结合蛋白4(GATA4)呈阳性表达。RT-PCR检测结果显示,支持细胞标志基因BMP4、SRY-box转录因子9基因(SOX9)、波形蛋白基因(Vimentin)、Wilm肿瘤抑制基因(WT1)、FAS细胞表面死亡受体基因(FAS)和胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)存在明显表达,而生精细胞标志基因出局区解旋酶4(DDX4)和类肌细胞标志基因半胱氨酸的血管生成诱导剂61(CYR61)无明显表达,间质细胞标志基因细胞色素P450家族11亚家族A成员1(CYP11A1)则有少量表达。BMP4在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中都有表达,且在牦牛支持细胞中的表达量显著高于犏牛支持细胞,而其受体基因ALK6、BMPR2、ACVR2A和ACVR2B在牦牛支持细胞中的表达量显著或极显著低于犏牛支持细胞。【结论】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离获得支持细胞,BMP4在牦牛支持细胞中表达量较高,暗示BMP4对犏牛精子发生具有潜在调控作用。

湖羊BMP2、BMP4、BMP6和BMP7基因mRNA表达水平与排卵数关系的研究

【目的】研究湖羊卵巢组织BMP2、BMP4、BMP6和BMP7基因mRNA表达水平与排卵数的相关性,筛选影响湖羊多胎性状的候选基因,为揭示湖羊高繁多胎分子遗传机理提供参考。【方法】选取16只经产湖羊母羊,分为产单羔组和多羔组,发情后24～36h屠宰,取卵巢,计数排卵点,记录排卵数;应用RT-PCR技术检测BMP2、BMP4、BMP6和BMP7基因的组织表达特征,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析各基因mRNA在单羔组和多羔组卵巢组织中的表达差异。【结果】BMP2、BMP4和BMP7基因在湖羊母羊卵巢组织内表达,而且在垂体及下丘脑、子宫、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、输卵管组织中均有表达;BMP6基因仅在湖羊母羊卵巢、肾脏、肌肉和输卵管组织中表达。在卵巢组织,多羔组排卵数极显著高于单羔组(P<0.01),且多羔组BMP4基因mRNA表达极显著高于单羔组(P<0.01),而BMP2、BMP6和BMP7基因mRNA表达在单羔组和多羔组间无显著差异(P>0.05);相关分析表明在卵巢组织中,只有BMP4基因mRNA表达与排卵数呈正相关(r=0.741,P<0.05)。【结论】BMP4基因mRNA表达在单羔组和多羔组间差异显著,可能对湖羊排卵数起关键作用,是影响湖羊排卵数的候选基因。

PTZ点燃癫痫大鼠海马NSE和BMP4的表达

目的观察神经元特异性烯醇酶(neuron-specific enolase,NSE)和骨形成蛋白4(bone morphogenic protein4,BMP4)基因在戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)点燃癫痫大鼠海马中的表达,并探讨两者与癫痫发病机制和脑损伤的关系。方法将50只成年雄性SD大鼠分为对照组和实验组。实验组采用PTZ点燃癫痫大鼠,按点燃进程,又随机分为Ⅰ级组、Ⅲ级组、Ⅳ级组和Ⅴ级组。用免疫组化技术、地高辛标记特异性寡核苷酸探针原位杂交组织化学技术和图像分析技术,观察海马NSE和BMP4表达的变化。结果发现应用PTZ点燃后,随发作级别的增高,大鼠海马各区NSE和BMP4的表达亦增加。在Ⅲ和Ⅳ级大鼠海马CA3及DG的NSE和BMP4表达明显高于对照组(P<0·01);Ⅴ级大鼠在发作后海马CA3及DG的NSE和BMP4表达呈逐渐下降。结论PTZ点燃可诱导癫痫海马内神经元损伤和神经发生增加,这可能是癫痫海马内神经元丢失、神经元可塑性的病理基础;NSE其表达水平与神经元损伤程度和预后密切相关;BMP4可能在PTZ癫痫形成过程中起重要作用。

BMP4对小鼠毛囊数量的影响

利用PolⅡ型人角蛋白14基因的启动子K14驱动eGFP-shRNA整合转录本的表达方法,制备在皮肤组织中高效表达靶向BMP4基因的siRNA转基因小鼠模型。利用Northern杂交的方法验证siRNA在转基因小鼠皮肤中高表达,但未从mRNA水平分析BMP4基因的表达变化。以建立的转基因小鼠模型为基础,检测小鼠皮肤组织中BMP4基因的表达变化,并观察妊娠18.5d(E18.5)转基因胎鼠与同窝阴性胎鼠背部皮肤组织切片中毛囊数量的变化,选择5个不同的视野进行毛囊数量计数后统计分析。结果表明,转基因小鼠皮肤组织中BMP4基因的表达下调,同时毛囊数量显著增加。表明利用融合表达载体制备转基因小鼠实现目的基因RNAi的方法可以有效地抑制动物体内目的基因的表达,同时也从胎鼠毛囊数量分析统计的结果发现,该基因对小鼠毛囊的发生发育有一定的影响。

BMP4通过诱导EMT促进肝癌迁移侵袭

目的:检测BMP4在肝癌中的表达并探讨BMP4在诱导肝癌EMT中的作用,进而研究其对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响。方法:采用免疫组织化学方法检测肝癌组织中BMP4的表达,分析其与肝癌临床病理资料之间的关系。将BMP4表达质粒转染至肝癌细胞系Hep G2中,诱导BMP4外源性过表达。观察BMP4转染前、后Hep G2的细胞形态学改变;Western blot检测转染前、后Hep G2中BMP4、EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin)表达变化情况;划痕和侵袭实验检测BMP4对细胞迁移侵袭能力的影响。结果:BMP4与患者的年龄、病理分级、临床分期、不良预后密切相关。BMP4过表达后Hep G2呈现典型的EMT形态学改变,E-cadherin表达下调、Vimentin表达上调、细胞的迁移侵袭能力显著增强。结论:BMP4与肝癌临床病理资料密切相关,并可能通过诱导EMT促进肝癌细胞的迁移侵袭能力。

BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

旨在探讨BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的作用机理。采用单层贴壁培养作为分化模式，分别采用10、20、30和40ng·mL-1 BMP4浓度诱导雄性鸡胚胎干细胞，通过形态学、荧光定量PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。根据细胞形态变化和差异基因表达量变化，确定了BMP4的适宜诱导浓度为40ng·mL-1。在适宜浓度诱导过程中，诱导4d类胚体开始出现，6～8d类胚体逐渐增大，数量增多，10d部分类胚体开始散开，变为小的圆形细胞，12d在散开后的类胚体周围可观察到少量生殖样细胞，14d生殖样细胞数目增多，且呈聚团生长的趋势。诱导过程中相应基因表达量也发生变化：胚胎干细胞标记基因Nanog、Sox2表达量显著下降（P〈O．01），生殖细胞特异基因Stra8、Dazl、integrina6、c-kit表达量均呈显著上升趋势（P〈O．01）。BMP4可以引起生殖细胞相应基因的表达，促进雄性鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞方向分化，结果为雄性生殖细胞的体外诱导研究提供试验参考，为进一步研究雄性生殖细胞发生和调控机制提供理论基础。

用RACE技术扩增并克隆牛BMP4基因3′端序列

RACE技术是一项扩增基因末端序列的新技术。该研究从牛BMP4基因出发,以牛软骨的RNA为模板,按照不同物种BMP4基因的相似性设计特异引物,运用PCR和RACE技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMP4的3′端序列,包含有1170bp组成的开放读码框(ORF),编码389个氨基酸,3′非编码区121bp个核苷酸和poly(A)15。同源性分析结果表明,牛BMP4 cDNA最大开放读码框所推测的氨基酸序列与已知人、小鼠、大鼠、狗、羊和鸡等真核生物BMP4氨基酸序列进行比较,分别有94.5%、93.1%、91.9%、87.4%、94.2%、79%的同源性。这为克隆其他物种的BMP4基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为我们更好的理解牛的生骨机理提供帮助。

bmp3、bmp4、bmp7在犬牙根发育过程中的表达研究

目的:探讨bmp3、bmp4、bmp7在牙根发育过程中的生理作用。方法:采用原位杂交染色技术,观测犬恒牙牙根发育各阶段标本中bmp3、bmp4、bmp7mRNA的定位表达。结果:bmp3的表达始于牙根发育早期的牙囊组织,之后转移到成牙骨质细胞和牙周膜细胞中;bmp4阳性信号在发育过程中主要位于成牙本质细胞层中;bmp7在牙根发育早期的颈环处上皮根鞘细胞有表达,而后还在分泌期的成牙骨质细胞和成牙本质细胞中表达。结论:bmp3、bmp4、bmp7在牙根发育过程中的表达具有时空特异性,提示它们参与调控牙根的发育。

BMP4基因作为中国美利奴羊(军垦型)多胎性能候选基因的研究

以绵羊BMP4基因作为候选基因,以中国美利奴羊(军垦型)为研究对象,利用PCR-SSCP和基因测序分析BMP4基因5'UTR、外显子和3'UTR的单核苷酸多态性(SNPs),研究该基因对中国美利奴羊(军垦型)高繁殖力的影响。结果表明,BMP4基因5'UTR和外显子不存在多态性,3'UTR存在6个碱基(ACACAC)插入/缺失,最小二乘分析表明6 bp插入/缺失对绵羊高产羔数的影响差异不显著(P>0.05),提示检测的BMP4基因座对中国美利奴羊(军垦型)高繁殖力没有影响。

鹅皮肤BMP4基因mRNA表达研究

采用荧光定量PCR方法研究BMP4基因mRNA在吉林白鹅胚胎期和生后期皮肤中表达变化规律,并采集21~29胚龄胎毛及40~130日龄鹅背部羽毛,观察羽毛生长发育规律及羽毛分支。结果表明：BMP4基因mRNA在鹅皮肤毛囊发育的整个过程中都有表达,胚胎期21~29胚龄表达量相对较低,40~70日龄时,鹅背部皮肤中BMP4mRNA表达量呈线性快速增加,在70日龄时BMP4mRNA相对表达量为2.575,是40日龄时相对表达量0.931的2.77倍,70~90日龄BMP4mRNA表达量有所下降,90~130日龄表达量呈线性快速增加,BMP4相对表达量在130日龄时达到了4.943,是40日龄时的5.31倍,是90日龄时相对表达量1.814的2.73倍。羽毛的长和直径以及羽小枝长和直径增长速度在90日龄后减慢,呈平稳增长状态。可见,BMP4基因在鹅羽毛快速发育时期低表达,在羽毛发育速度较慢的时期高表达,且在片羽分支阶段高表达,可能与羽毛分支有一定关系。

不同绵羊群体BMP4基因多态性与产羔数关系分析

以BMP4基因为候选基因,采用PCR-SSCP方法,分析了小尾寒羊和无角陶赛特及其杂交F1代、F2代的BMP4基因的不同基因型频率,并对该位点不同基因型与产羔数之间的关系进行了分析。结果显示:小尾寒羊BB、B+、++基因型频率分别是1.0%、29.7%、69.2%;无角陶赛特BB、B+、++型频率分别为0、80.8%、19.2%;陶寒F1代BB、B+、++基因型频率分别为5.3%、39.4%、55.3%;陶寒F2代BB、B+、++型基因型频率分别为0、5.0%、95.0%。小尾寒羊的基因型++、B+、BB平均产羔数分别为(1.00±0.00)、(1.67±0.11)、(2.40±0.13),经χ2检验,差异极显著(P<0.01);陶寒F1代的基因型++、B+、BB平均产羔数分别为(2.00±0.00)、(2.45±0.53)、(2.00±0.00),经χ2检验,++、BB组与B+组的平均产羔数间的差异极显著(P<0.01);B基因不能提高无角陶塞特母羊产羔数。

Noggin mRNA与BMP4 mRNA在不同发育年龄大鼠海马与大脑皮层的表达

目的 观察不同发育年龄大鼠前皮质与海马内nogginmRNA与BMP4mRNA表达的变化特点。方法 应用RT PCR技术进行半定量分析。结果 在大鼠前皮质 ,nogginmRNA的表达在P1W明显降低 ,BMP4mRNA在P1M、P3M呈高表达。而在大鼠海马 ,nogginmRNA的表达在胚胎期 (E13、E16)表达最高 ,随着发育的进行逐渐降低 ;BMP4在不同发育阶段大鼠海马内的表达模式和noggin相反 ,即在胚胎期及新生期呈弱阳性表达 ,生后 1周表达开始升高 ,生后 2周明显升高 ,并维持这一较高水平 ,在生后 18月大鼠仍维持较高的水平。结论 NogginmRNA与BMP4mRNA在不同发育年龄大鼠的海马与前皮质均有表达 ,表达水平与发育年龄密切相关。Noggin基因与BMP4基因与海马及皮层的发育密切相关。

癌性贫血患者血清BMP6和BMP4水平变化及其与Hepcidin和s-HJV的关系

目的 研究癌性贫血患者中骨形成发生蛋白（BMP6）和BMP4的表达水平,以及与铁调素调节蛋白（s-HJV和Hepcidin之间的关系.方法 应用双抗夹心生物素亲和素-酶联免疫吸附试验方法检测53例癌性贫血患者和52例无贫血癌症患者的血清BMP6,BMP4,s-HJV和Hepcidin水平,并分析它们之间的相互关系.结果 ①贫血组BMP6和Hepcidin分别为434.53±212.11 ng/ml和5.68±3.89 μg/L,均高于无贫血组癌症患者（334.37±171.32 ng/ml和4.60±2.28 μg/L）（分别为P＜0.01或P＜0.05）;s-HJV则为0.69±0.28 ng/ml,明显低于无贫血组癌症患者1.07±1.00 ng/ml（P＜0.01）.而癌症贫血患者的BMP4表达水平与癌症无贫血患者比较,差异无统计学意义.②BMP6与s-HJV,Hb均呈负相关（r=-0.253 6,-0.294 9;P均＜0.01）,但与Hepcidin不相关.而BMP4则与Hb,s-HJV和Hepcidin三者均无相关关系.结论 癌性贫血患者高表达BMP6和Hepcidin,低表达s-HJV.BMP6和s-HJV呈负相关关系,BMP6,s-HJV和Hepcidin在贫血的发生发展中起重要的作用.

藏系绵羊BMP4基因克隆及组织表达分析

本试验旨在获得藏系绵羊BMP4基因序列,并分析其生物学特征,同时阐明该基因在不同组织中的表达情况。利用RT-PCR技术克隆藏系绵羊BMP4基因序列,利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测其在藏系绵羊各个组织中的表达丰度。结果表明,获得藏系绵羊BMP4基因CDS序列1230bp,共编码409个氨基酸,为不稳定亲水碱性蛋白;与绵羊、牛、山羊、小鼠和人的氨基酸序列具有98%以上的相似性;潜在的磷酸化位点共33个。qPCR结果显示BMP4基因在藏系绵羊的各个组织中均存在广泛表达,且在肺组织中表达水平最高,极显著高于其他组织(P<0.01)。本研究为进一步阐明BMP4基因在藏系绵羊脂质代谢中的功能奠定了基础。

哺乳动物BMP4基因A型启动子的比较分析

以鸭嘴兽BMP4基因组序列为模型,采用比较基因组学方法分析哺乳动物BMP4基因A型启动子的结构特点。该研究分离出一段长112bp的进化上高度保守的核心启动子序列以及多个转录因子结合位点和CpG岛结构,并且在BMP4核心启动子区域发现了2种具有重要生物学功能的回文结构,为进一步研究该型启动子的转录调控功能提供了理论基础。同时以鸭嘴兽基因组为参照模型,也为今后研究其他哺乳动物进化上保留下来的基因提供更多新信息。

鸡胚Bmp4和Cath1原位杂交RNA探针的制备

目的介绍一种鸡胚原位杂交探针制备方法。方法携带Bmp4和Cath1基因特异片段的质粒载体,通过质粒小提试剂盒扩增,限制性内切酶线性化,酚氯仿抽提纯化,T3 RNA聚合酶体外转录,合成地高辛标记的反义探针,通过电泳及鸡胚原位杂交检测探针的质量.结果获得了效果良好的Bmp4和Cath1的RNA探针.结论用质粒小提试剂盒对质粒载体扩增,进而通过线性化、纯化、转录等步骤来制备原位杂交探针的方法,具有时间短、费用低、质量高、杂交效果好等优点。