Cyclin D1在黄芪甲苷诱导BMSCs向神经元样细胞分化中的表达

目的:研究黄芪甲苷诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化的特点和诱导过程中Cyclin D1的表达特点。方法:采用100 mg·L^(-1)黄芪甲苷诱导BMSCs分化,在1、12、24 h倒置显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法观察巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、Cyclin D1的表达,RT-PCR检测Cyclin D1 mRNA的表达。结果:收集获得的骨髓细胞采用原代和传代培养,至第3代BMSCs细胞基本纯化。经100 mg·L^(-1)黄芪甲苷作用后,部分细胞自胞体长出突起,形态似神经元样细胞且表达Nestin和NSE抗体,Nestin的表达时相早于NSE且表达强度高于NSE(P<0.05)。在药物作用1 h后,BMSCs细胞Cyclin D1不论在基因转录水平还是在蛋白表达水平均出现大幅度下调,此时BMSCs开始有Nestin的表达;药物作用12、24 h,BMSCs细胞Cyclin D1表达与药物作用前表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论:黄芪甲苷可能首先通过调整细胞周期,延长了G1期向S期转变的时间,从而启动了BMSCs的分化程序,诱导BMSCs向神经干细胞分化。在黄芪甲苷的营养作用下,细胞的突起进一步生长并向神经元分化。

神经生长因子联合BMSCs-源外泌体通过Keap1/NQO1/Nrf2信号通路缓解脑出血大鼠神经损伤

目的探讨大鼠神经生长因子(rat nerve growth factor,RtNGF)联合骨髓间充质干细胞-源外泌体(BMSCs exosomes)缓解脑出血(intracerebral haemorrhage,ICH)大鼠神经损伤的疗效及其作用机制。方法制备BMSCs exosomes。60只大鼠随机分为假手术(Sham)组,ICH组,ICH+RtNGF组,ICH+BMSCs exosomes组,ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组,每组12只。建立ICH大鼠模型,并给予RtNGF或BMSCs exosomes单独治疗或联合治疗。制备各分组大鼠脑组织石蜡组织切片,并对其进行HE染色。qPCR法测定各分组大鼠脑组织中Keap1/NQO1/Nrf2信号通路蛋白质因子mRNA的相对表达水平。免疫组化(IHC)法测定各分组大鼠脑组织中Keap1/NQO1/Nrf2信号通路蛋白质因子的表达水平。结果与Sham组相比,ICH组大鼠脑组织中存在多处明显的组织腔隙和血凝块。ICH+RtNGF组、ICH+BMSCs exosomes组和ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组均有所改善,且ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组缓解神经损伤效果最好。与Sham组相比,ICH组大鼠脑组织中Keap1,NQO1和Nrf2 mRNA表达水平升高(P<0.05);上述3种蛋白质IHC相对染色评分升高(P<0.05)。与ICH组相比,ICH+RtNGF组、ICH+BMSCs exosomes组和ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组上述检测指标水平降低(P<0.05),且与ICH+RtNGF组或ICH+BMSCs exosomes组相比,ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组上述检测指标水平更低(P<0.05)。结论RtNGF联合BMSCs exosomes治疗ICH大鼠,可通过Keap1/NQO1/Nrf2信号通路降低氧化应激缓解神经损伤。

基于BMSCs淫羊藿-仙茅-巴戟天角药抗骨质疏松药效物质提取工艺研究

目的筛选淫羊藿-仙茅-巴戟天角药抗骨质疏松药效物质的最佳提取工艺。方法采用正交设计,选取提取时间、料液比、乙醇浓度为考察因素,以BMSCs细胞增殖率结合淫羊藿苷、总黄酮含量为考察指标,筛选淫羊藿-仙茅-巴戟天角药抗骨质疏松药效物质的最佳提取工艺,并对最佳提取条件进行验证。结果兼顾生产效率和节约能源,优选出淫羊藿-仙茅-巴戟天角药药效物质的最佳提取条件为提取时间1.5 h,乙醇浓度55%,溶剂用量10倍。验证实验结果BMSCs细胞增殖率、淫羊藿苷及总黄酮含量与工艺考察结果非常接近。结论该方法在保证淫羊藿-仙茅-巴戟天角药治疗骨质疏松的药效基础上,结合淫羊藿苷及总黄酮含量进行综合评价,优化提取工艺,使得实验结果更科学合理。

抑制PPARγ表达对BMSCs成骨分化的影响

目的探究抑制过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)表达对BMSCs成骨分化的影响,为原发性骨质疏松症(primary psteoporosis,POP)的治疗提供理论基础。方法将骨密度正常患者提取的BMSCs分为正常对照组(CON组),POP患者提取的BMSCs分为原发性骨质疏松组(POP组),取POP组细胞加入PPARγ抑制剂,分为抑制剂组(INR组),经成骨诱导分化后,检测各组细胞中骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Osterix、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达情况;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色观察各组BMSCs成骨分化情况。结果POP组ALP阳性细胞数低于CON组和INR组(P<0.05);与CON组相比,POP组中OCN、OPN、Osterix、Runx2表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与POP组相比,INR组中OCN、OPN、Osterix、Runx2表达量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论抑制PPARγ表达后,BMSCs成骨分化特异性基因(ALP、OCN、OPN、Osterix、Runx2)表达增加。

仿生聚乳酸纤维膜对大鼠BMSCs成骨分化的影响

目的:探讨微观形貌仿生的聚乳酸纤维膜对大鼠BMSCs生长、铺展、黏附、增殖和成骨分化的影响。方法:取第3代rBMSCs,按1×105个/mL密度接种于覆盖不同直径聚乳酸纤维膜的细胞培养板上,分别为仿生组(A组)直径(357±32)nm、有形貌对照组(B、C组)直径分别为(164±13)nm、(1311±93)nm,无形貌空白对照组(Ctrl组),在成骨分化实验时增设成骨诱导阳性对照组(Positive组)。扫描电镜观察BMSCs生长、铺展;CCK-8试剂盒检测BMSCs增殖、黏附;实时荧光定量PCR检测Runx2、COLI、ALP、OSX的mRNA表达;Western Blot检测骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OC)的表达。结果:扫描电镜示:A、B二组上细胞具有明显聚集区域,相互联系紧密;单个细胞形态观察,A组较B、C及Ctrl组,细胞铺展面积更大、伪足更多。黏附实验示:在8h、16h,A、B组均高于C组(P<0.05)。增殖实验示:第3、5、7、9天,Ctrl组、A组、B组增殖情况均优于C组(P<0.05),三组间对比,Ctrl组优于A、B组(P<0.05);第7、9天A组增殖情况优于B组(P<0.05)。实时荧光定量PCR显示:在第3、10天,A、Positive组ALP、COLI、Runx2、OSX的mRNA表达量均明显高于B、C及Ctrl组(P<0.05);A组低于Positive组(P<0.05)。蛋白质印迹示:第10天,A、Positive组OPN、OC表达量均明显高于B、C、Ctrl组(P<0.05);A组OC表达量低于Positive组(P<0.05);B、C、Ctrl三组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:微观形貌仿生的聚乳酸纤维膜能促进rBMSCs黏附、增殖、成骨分化。

炎性微环境下TGF-β1通过TGF-β1/Smad3通路促进BMSCs成骨分化

目的研究炎性微环境下转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及作用机制。方法应用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)体外模拟炎性微环境,检测不同浓度TGF-β1对BMSC增殖活性的影响。实验分为对照组[BMSC+成骨诱导液(osteogenic medium,OM)]、实验组(BMSC+TGF-β1+OM)和抑制组[BMSC+SB431542(TGF-β1拮抗剂)+OM]。应用ALP染色、茜素红染色、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)及Western blot法对BMSCs成骨分化能力和TGF-β信号通路因子Smad2、Smad3进行检测并比较3组间的差异。结果低浓度TGF-β1作用下BMSCs增殖活性较高,高浓度(50ng/ml)抑制BMSCs增殖活性;成骨诱导7天和10天时,实验组与其他两组比较,ALP染色较深、面积最大;茜素红染色结果显示,实验组体外矿化结节形成均高于其他两组;RT-qPCR检测结果显示,实验组成骨分化基因OPN、RUNX2与ALP表达均增高,TGF-β信号通路中Smad3在实验组表达最高,抑制组表达最低,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot法检测结果显示,实验组内OPN、RUNX2与ALP蛋白表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β信号通路中Smad3蛋白表达在3组中差异不明显,而p-Smad3在实验组中表达明显增高、抑制组中明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论炎性微环境中TGF-β1通过激活TGF-β/Smad3信号通路促进了BMSCs成骨分化。

压力作用下血小板反应蛋白-2通过调控黏着斑形成促BMSCs成软骨分化的研究

目的力学刺激在软骨发育和软骨组织稳态维持中有重要作用。前期研究发现,动态压力刺激促进BMSCs成软骨分化的过程中,伴随血小板反应蛋白-2(TSP-2)的表达上调,且TSP-2与BMSCs成软骨分化密切相关,但其作用机制尚未完全阐明。本研究采用外源性TSP-2多肽以及慢病毒干扰TSP-2表达后,检测动态压力下TSP-2在BMSCs成软骨分化中的作用及机制。方法体外分离培养BMSCs,分为对照组、TSP-2组、sh TSP-2组、压力组、压力+TSP-2组和压力+sh TSP-2组;免疫荧光染色法检测细胞中FAK的表达,并对黏着斑数量进行统计分析;采用超低黏附培养皿对BMSCs行3D培养,倒置光学显微镜观察细胞团块并拍照;Western blotting检测细胞团块中成软骨标志蛋白Sox9的表达;结果贴壁培养的sh TSP-2组、压力组和压力+sh TSP-2组BMSCs中,FAK的表达水平和黏着斑数量显著高于对照组(P<0.05),压力+TSP-2组与压力组相比黏着斑数量显著下调(P<0.05);sh TSP-2组和压力+sh TSP-2组中细胞团块存在大量未聚集的细胞;Western blotting结果显示TSP-2组、压力组、压力+TSP-2组细胞团块中Sox9的表达显著高于对照组(P<0.05)。结论动态压力刺激下TSP-2通过抑制BMSCs黏着斑的形成,促BMSCs向成软骨方向分化。

基于SDF-1/CXCR4轴探讨补肾壮筋汤促进小鼠BMSCs归巢和保护关节软骨的机制研究

目的探讨补肾壮筋汤调控SDF-1/CXCR4轴促进小鼠BMSCs归巢和保护关节软骨的作用机制,为膝骨关节炎(KOA)的康复治疗提供实验依据。方法①动物实验中,选用8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠30只,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、补肾壮筋汤组,每组10只,干预12周。采用micro-CT、HE染色观察各组软骨形态变化;激光共聚焦显微镜观察骨组织SDF-1荧光强度;qPCR、Western blot检测各组归巢相关调控因子mRNA转录水平和蛋白相对表达量。②细胞实验中,选用4周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,采用全骨髓贴壁法提取原代BMSCs,流式细胞术对所提取的细胞进行鉴定后,筛选最佳慢病毒MOI值;随机将细胞分为空白组、空载组、补肾壮筋汤组、sh-SDF-1组、sh-SDF-1+补肾壮筋汤组5组,采用划痕实验观察各组BMSCs迁移情况;阿利新蓝、CollagenⅡ免疫细胞学染色观察各组细胞成软骨分化能力;激光共聚焦显微镜观察各组SDF-1、CXCR4的荧光强度;qPCR检测各组归巢相关调控因子mRNA转录水平。结果①动物实验中,关节组织形态学结果(micro-CT、HE染色)显示:与假手术组比较,模型组股骨髁间可见一圆形缺损,骨皮质失连,软骨细胞缺失;与模型组比较,补肾壮筋汤组股骨髁间环形缺损好转,软骨细胞排列稍紊乱。关节组织免疫荧光显示:与假手术组比较,模型组SDF-1蛋白相对表达量升高;与模型组比较,补肾壮筋汤组SDF-1的蛋白相对表达量升高(P<0.05)。qPCR与Western blot结果显示:与假手术组比较,模型组归巢关键调控因子(SDF-1、CXCR4、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β、RANTES、VEGF、G-CSF、NCAM-1、MMP-2)的mRNA转录水平和蛋白相对表达量升高(P<0.05);与模型组比较,补肾壮筋汤组归巢关键调控因子mRNA转录水平和蛋白相对表达量升高(P<0.05)。②细胞实验中,BMSCs经细胞流式术鉴定:CD44、CD105呈阳性表达,CD34呈阴性表达。当病毒MOI值为100时,SDF-1基因感染率最高。BMSCs迁移和成软骨分化能力检测结果显示:与空白组比较,sh-SDF-1组细胞向划痕区域迁移的细胞数量、酸性黏多糖及CollagenⅡ蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);补肾壮筋汤组和sh-SDF-1+补肾壮筋汤组迁移的细胞数量、阿利新蓝染色及CollagenⅡ蛋白相对表达量显著增多(P<0.05)。细胞免疫荧光显示:与空白组比较,sh-SDF-1组细胞SDF-1、CXCR4蛋白相对表达量显著减少;补肾壮筋汤组和sh-SDF-1+补肾壮筋汤组细胞SDF-1、CXCR4蛋白相对表达量显著增多(P<0.05)。qPCR结果显示:与空白组比较,sh-SDF-1组归巢关键调控因子的mRNA转录水平降低(P<0.05),补肾壮筋汤组归巢关键调控因子的mRNA转录水平升高(P<0.05)。结论补肾壮筋汤可通过上调SDF-1/CXCR4轴促进小鼠BMSCs归巢保护关节软骨。

静水压力对BMSCs凋亡的影响及凋亡外囊泡特异性microRNA的研究

目的明确不同静水压力作用对BMSCs细胞凋亡的影响,并筛选压力作用下BMSCs凋亡囊泡表达的差异mi RNA。方法分离培养大鼠BMSCs并鉴定;细胞分为对照组、压力作用组(-40 k Pa,0.1 Hz作用1 h)、STS作用组(0.5μM,16 h),梯度离心法提取凋亡囊泡;CCK8检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western Blotting检测细胞凋亡标志物的表达及凋亡囊泡标志物的表达,NTA检测凋亡囊泡尺寸及浓度。采用高通量mi RNA测序技术对压力作用下BMSCs凋亡囊泡相关差异mi RNA进行筛选。结果采用全骨髓贴壁的方法分离培养的大鼠BMSCs可高表达干细胞表面标志物CD90、CD29、低表达造血细胞表面标志物CD34、CD45,并具有较强的克隆形成能力和多向分化的能力,为间充质干细胞。适当的静水压力处理可显著降低BMSCs细胞活性,促进其凋亡发生,并且-40 KPa压力作用下BMSCs凋亡率最高,且凋亡囊泡产生数量显著多于对照组。采用测序技术发现,-40 KPa压力作用产生的凋亡囊泡差异性表达mi R-183-5p和mi R-3473。结论适当的静水压力可以促进BMSCs的凋亡,并且-40 KPa压力作用下BMSCs凋亡囊泡差异性表达抗炎相关基因mmi R-183-5p和mi R-3473。

爱帕琳肽13对GK大鼠BMSCs骨向分化及线粒体呼吸功能的影响

目的探讨爱帕琳肽13(Apelin-13)对GK大鼠BMSCs骨向分化及线粒体呼吸功能的影响。方法分离、培养GK糖尿病大鼠BMSCs。成骨诱导培养后,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,Von Kossa染色观察钙结节矿化程度,O2K线粒体呼吸仪测定不同状态下线粒体呼吸功能。结果Apelin-13增强GK糖尿病大鼠BMSCs的ALP活性;促进钙结节矿化;与GK组比较,Apelin-13有效提高两种状态下线粒体呼吸功能:复合物Ⅰ态3呼吸[(16.1±1.8)vs.(5.6±0.9)]pmol/(s×ml),复合物Ⅰ+复合物Ⅱ态3呼吸[(71.1±8.6)vs.(49.0±4.8)]pmol/(s×ml)。结论Apelin-13可促进GK大鼠BMSCs骨向分化,并提高其线粒体呼吸功能。

补阳还五汤通过调控PI3K/Akt、JAK2/STAT3信号促进BMSC趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠神经元活性及认知功能的影响

目的研究补阳还五汤通过调控磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、内源性酪氨酸激酶(JAK)2/信号传导和转录启动因子(STAT)3信号促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)趋化迁移对外伤性脊髓损伤大鼠的神经元活性及认知功能的影响。方法选取健康大鼠53只,随机分为健康组(健康大鼠常规饲养)、损伤组(建立脊髓损伤模型)、干预组(补阳还五汤治疗)、对照组(甲泼尼龙治疗),每组12只,剩余5只大鼠用于补阳还五汤含药血清制备。流式细胞术鉴定BMSCs细胞。Transwell小室法测大鼠BMSCs迁移。高架十字迷宫和Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能。苏木素-伊红(HE)染色检测脊髓组织病理形态。TUNEL测脊髓组织神经细胞凋亡。免疫组化检测p-JAK2、p-STAT3。Western印迹测PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt。结果传代后的培养细胞呈旋窝状或放射状贴壁生长,细胞多呈星形、梭形或三角状,培养3代后,细胞贴壁加快、形态均一,呈旋窝状或单层放射状生长。培养细胞表面抗原CD29、CD90为阳性,CD31、CD45为阴性,提示其为BMSCs细胞。与健康组相比,损伤组总路程、进入开臂次数、穿越平台次数显著降低,不同时间的潜伏期显著升高(P<0.05)。与损伤组相比,干预组与对照组总路程、进入开臂次数、穿越平台次数显著升高,不同时间的潜伏期显著降低(P<0.05)。干预组与对照组各指标对比无统计学差异(P>0.05)。健康组脊髓组织结构完整。损伤组脊髓组织疏松水肿,有细胞空泡变性产生。相较于损伤组,干预组与对照组大鼠脊髓组织病理形态有所改善。与健康组相比,损伤组BMSCs、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt显著降低,神经细胞凋亡率、p-JAK2、p-STAT3显著升高(P<0.05)。与损伤组相比,干预组BMSCs、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt显著升高,神经细胞凋亡率、p-JAK2、p-STAT3显著降低(P<0.05)。干预组与对照组各指标水平无统计学差异(P>0.05)。结论补阳还五汤通过激活PI3K/Akt通路抑制JAK2/STAT3信号通路的激活,促进BMSCs的迁移,减轻神经细胞的凋亡,起到神经保护的作用,从而改善脊髓损伤大鼠的认知功能。

SDF-1表达升高促进骨髓间充质干细胞(BMSC)迁移减轻哮喘大鼠气道炎症

目的 观察基质细胞衍生因子1(SDF-1)与骨髓间充质干细胞(BMSC)迁移及哮喘大鼠气道炎症的相关性。方法 取24只清洁级SD大鼠,随机均分为正常对照组、模型组、BMSC组;除对照组外,其余两组予卵清蛋白致敏激发制备哮喘模型,BMSC组于造模完成当天由尾静脉注射1 mL 106个BMSC。采用HE染色观察肺组织病理形态变化;Wright-Giemsa染色,光镜下计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中各种炎细胞数量;ELISA检测BALF中白细胞介素4(IL-4)、IL-5、IL-13、IgE、IgG1、IgG2a含量;反转录PCR检测肺组织中SDF-1、信号转导子与转录激活子6(STAT6)的mRNA表达;免疫荧光细胞化学染色检测支气管上皮细胞中SDF-1的蛋白表达;Western blot法检测肺组织SDF-1、STAT6蛋白水平。结果 与对照组相比,模型组BALF中炎细胞计数及IL-4、IL-5、IL-13、IgE、IgG1、IgG2a含量显著升高;肺组织SDF-1、STAT6 mRNA和蛋白表达量显著升高;支气管上皮细胞SDF-1表达明显升高。与模型组相比,BMSC组BALF中炎细胞数目及炎性细胞因子含量均减少;肺组织STAT6 mRNA和蛋白表达降低,SDF-1基因表达量有所升高;支气管上皮细胞SDF-1蛋白表达增加。结论 哮喘炎症过程中,受损部位的趋化因子SDF-1的表达升高,并促进BMSC向哮喘大鼠肺组织迁移。BMSC通过归巢至受损肺组织发挥调节Th1细胞/Th2细胞免疫失衡的作用,从而抑制哮喘气道炎症。

BMSCs对骨质疏松性骨折模型大鼠的影响及作用机制

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对骨质疏松性骨折模型大鼠的影响及作用机制。方法将48只雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、骨质疏松性骨折组、BMSCs处理的骨质疏松性骨折组,比较骨生物力学变化情况及骨密度和骨超声振幅衰减程度;同时测量椎体骨组织形态学指标:骨小梁体积百分比、骨小梁表面百分比、骨小梁平均宽度、矿化沉积率;酶联免疫吸附试验测定血清骨碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原交联C-末端肽水平。结果骨质疏松性骨折组右侧股骨和L5椎体的弹性模量、最大载荷明显低于假手术组,BMSCs处理的骨质疏松性骨折组上述指标荷明显高于骨质疏松组(P<0.05)。骨质疏松性骨折组骨密度、超声衰减程度明显低于假手术组,BMSCs处理的骨质疏松性骨折组上述指标明显高于骨质疏松性骨折组(P<0.05)。骨质疏松性骨折组骨小梁体积百分比、骨小梁平均宽度明显低于假手术组,骨小梁表面百分比、矿化沉积率明显高于假手术组(P<0.05);BMSCs处理的骨质疏松性骨折组骨小梁体积百分比、骨小梁平均宽度明显高于骨质疏松性骨折组,骨小梁表面百分比、矿化沉积率明显低于假手术组(P<0.05)。骨质疏松性骨折组血清骨碱性磷酸酶明显低于假手术组,Ⅰ型胶原交联C-末端肽水平明显高于假手术组(P<0.01);BMSCs处理的骨质疏松性骨折组血清骨碱性磷酸酶明显高于假手术组,Ⅰ型胶原交联C-末端肽水平明显低于假手术组(P<0.01)。结论BMSCs能够明显改善骨质疏松性骨折模型大鼠的骨生物力学和骨组织形态学指标,提升骨密度,可能与上调骨碱性磷酸酶表达、下调Ⅰ型胶原交联C-末端肽表达有关。

中医药调控BMSCs成骨分化防治骨质疏松症的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化与成脂分化不平衡是导致骨质疏松症(OP)的主要原因之一,故在治疗OP方面,调控BMSCs的增殖、分化已成为重要手段。大量研究显示中药及其复方可以通过调节相关基因及通路的表达诱导BMSCs增殖、迁移及成骨分化,从而达到防治骨质疏松症的目的。近年来,中医药在防治OP方面的优势不断扩大。故本文结合中药及其复方调控BMSCs成骨分化防治OP的医学研究,为中医药防治OP提供相关依据。

Ferrostatin-1抑制高糖诱导的小鼠BMSC铁死亡并防治糖尿病骨质疏松

目的探讨铁死亡抑制剂对糖尿病骨质疏松模型小鼠的治疗作用。方法体外研究采用Ferrostatin-1干预小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨分化,并检测成骨分化及铁死亡标志基因的表达;体内研究采用Ferrostatin-1干预糖尿病骨质疏松模型小鼠,并检测小鼠空腹血糖、体重、松质骨相关参数。结果体外研究显示,与对照组相比,高糖环境下,BMSC的成骨分化能力被抑制,Ferrostatin-1(10μmol/L)能够挽救高糖抑制的成骨分化,差异存在统计学意义。体内研究显示,与对照组相比,Ferrostatin-1可以有效降低糖尿病模型小鼠的空腹血糖,并增加体重,且差异均有统计学意义。与对照组相比,糖尿病模型鼠骨小梁面积百分数、骨小梁宽度、骨小梁数量下降,且差异有统计学意义;与模型组相比,Ferrostatin-1治疗组骨小梁面积百分数、骨小梁宽度、骨小梁数量增加,且差异有统计学意义。结论Ferrostatin-1抑制高糖高脂环境下的BMSC铁死亡,防治糖尿病性骨质疏松。

GH/IGF-1系统在BMSCs成脂分化过程中作用机制的实验研究

目的研究温肾健脾、活血化瘀含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化作用过程中生长激素(GH)/胰岛素样生长因子1(IGF-1)系统的调节机制。方法将40只SPF级雄性SD大鼠用随机数字表法分成4组,依次为正常组、成脂诱导组、温肾健脾组、活血化瘀组。对大鼠进行7 d灌胃,制备含药血清,按一定比例将含药血清与完全培养基进行配比用以BMSCs成脂分化的培养。油红O染色观察BMSCs成脂分化情况后,用ELISA法测定脂肪细胞中GH、IGF-1的蛋白水平。结果GH蛋白表达水平结果:与正常组比较,成脂诱导组低于正常组,差异不具有统计学意义(P>0.05)。与成脂诱导组相比,温肾健脾组、活血化瘀组结果均优于成脂诱导组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。温肾健脾组与活血化瘀组相比,活血化瘀组结果优于温肾健脾组。②IGF-1蛋白表达水平结果:与正常组相比,成脂诱导组结果高于正常组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。与成脂诱导组相比,温肾健脾组、活血化瘀组结果均低于成脂诱导组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。温肾健脾组、活血化瘀组相比,活血化瘀组结果高于温肾健脾组。结论温肾健脾、活血化瘀中药可能通过GH/IGF-1系统发挥抑制BMSCs的成脂分化作用。

LncRNA与miRNA的相互作用调控BMSCs谱系分化的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨与成脂分化失衡是导致骨质疏松症(OP)的主要原因之一,在治疗骨质疏松症方面,调控BMSCs的谱系分化已成为当前主要手段。随着生物学研究的不断深入,长链非编码蛋白RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)均广泛参与调控BMSCs谱系分化的过程。大多数miRNA可作为内源性竞争性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)调控lncRNA的表达进程,许多lncRNA还充当miRNA的ceRNA以调节影响不同途径的miRNA靶向基因的表达。二者之间的相互作用对于调控BMSCs谱系分化有着更为明显的优势,故本文围绕其进行综述,为临床治疗骨质疏松症寻找新的理论和实验依据。

BMSCs介导STAT3对脑出血大鼠海马组织eIF2α、Glu表达水平的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑出血(ICH)大鼠海马组织真核细胞翻译起始因子2α亚基(eIF2α)、谷氨酸(Glu)表达水平的影响及其机制。方法100只SD大鼠,随机选取10只分离BMSCs,剩余90只采用Ⅳ型胶原酶构建ICH模型。90只大鼠随机分为假手术组、ICH组和BMSCs移植组,每组30只。造模成功后24h,BMSCs移植组大鼠经尾静脉注入BMSCs,其余2组注入等体积0.9%氯化钠溶液。观察大鼠一般情况,评估神经功能,测定脑组织含水量。蛋白印迹测定海马组织内质网应激相关因子、eIF2α及JAK/STAT3通路蛋白水平,高效液相色谱法测定Glu浓度,TUNEL法分析细胞凋亡情况。结果ICH组大鼠神经功能缺损评分(NSS)和脑组织含水量显著大于假手术组,海马组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)蛋白相对表达量显著低于假手术组,CAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和Caspase-12蛋白相对表达量显著高于假手术组,海马组织eIF2α蛋白相对表达量和Glu水平显著高于假手术组,海马神经细胞凋亡率显著高于假手术组,海马组织JAK、p-JAK、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达量显著低于假手术组(P<0.05);与ICH组比较,BMSCs移植组大鼠NSS评分和脑组织含水量显著降低,海马组织GRP78蛋白相对表达量显著增加,CHOP和Caspase-12蛋白相对表达量显著降低,eIF2α蛋白相对表达量和Glu水平显著降低,海马神经细胞凋亡率显著降低,海马组织JAK、p-JAK、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达量显著增加(P<0.05)。结论BMSCs移植可通过JAK/STAT3通路降低ICH大鼠海马组织eIF2α和Glu表达,抑制神经细胞凋亡,减轻内质网应激,从而达到减轻脑损伤,改善神经功能作用。

Wnt/β-catenin通路在新北美圣草苷促进BMSCs成骨分化中的介导作用

目的:探究新北美圣草苷激活Wnt/β-catenin通路促进骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)成骨分化的具体机制,为其应用于临床治疗提供理论基础。方法:选取SPF级3月龄大鼠30只,随机分为对照组、低剂量组、高剂量组,每组10只,分别给予生理盐水、0.81g/kg及4.05g/kg骨碎补水煎液灌胃并制备含药血清。培养并鉴定BMSCs。以不同浓度含药血清干预BMSCs并比较各组的细胞增殖能力,矿化能力,β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2、GSK-3βmRNA表达水平及β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平。结果:与对照组相比,给药两组各时间点的细胞增殖能力更强,且高剂量组优于低剂量组;与对照组相比,给药两组的矿化结节数量明显升高,且高剂量组矿化结节数量多于低剂量组;给药两组的GSK-3βmRNA表达明显低于对照组,且高剂量组低于低剂量组,β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2 mRNA表达明显高于对照组,且高剂量组高于低剂量组;同时给药两组的β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平明显高于对照组,且高剂量组高于低剂量组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:新北美圣草苷可能通过激活Wnt/β-catenin通路,上调β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2 mRNA表达并下调GSK-3βmRNA表达,同时上调β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平,进而促进BMSCs增殖和成骨分化。

BMSCs外泌体来源miR-133a对大鼠脊髓损伤修复的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体来源miR-133a对大鼠脊髓损伤(SCI)修复的影响。方法原代分离和培养BMSCs,测定BMSCs细胞表面标记物(CD90,CD45)表达;提取BMSCs外泌体,观察外泌体形态及外泌体标记分子(Alix、CD63)表达;建立SCI大鼠模型,随机将大鼠分为假手术组、SCI组、外泌体组、外泌体-抑制剂对照(NC)组、外泌体-miR-133a抑制剂组,28 d后,对各组大鼠进行BBB评分评估脊髓损伤程度;分离大鼠骨髓组织,检测该组织病理学变化、细胞凋亡状况;同时检测相关蛋白[胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元核抗原(NeuN)、炎性小体3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)-1]及miR-133a表达水平。双荧光素酶实验验证miR-133a、NLRP3靶向关系。结果BMSCs细胞中CD90、CD45表达率分别为98.07%、0.09%。外泌体呈球形,Alix、CD63呈阳性表达。与假手术组比较,SCI组BBB评分、NeuN、miR-133a表达显著降低,细胞凋亡率、GFAP、NLRP3、caspase-1表达显著增加(P<0.05);与SCI组比较,外泌体组BBB评分、NeuN、miR-133a表达显著增加,细胞凋亡率、GFAP、NLRP3、caspase-1表达显著降低(P<0.05);抑制miR-133a表达逆转了外泌体对SCI大鼠的修复作用(P<0.05)。结论BMSCs外泌体来源miR-133a,可对SCI大鼠起到修复作用。