Cyclin D1在黄芪甲苷诱导BMSCs向神经元样细胞分化中的表达

目的:研究黄芪甲苷诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化的特点和诱导过程中Cyclin D1的表达特点。方法:采用100 mg·L^(-1)黄芪甲苷诱导BMSCs分化,在1、12、24 h倒置显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法观察巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、Cyclin D1的表达,RT-PCR检测Cyclin D1 mRNA的表达。结果:收集获得的骨髓细胞采用原代和传代培养,至第3代BMSCs细胞基本纯化。经100 mg·L^(-1)黄芪甲苷作用后,部分细胞自胞体长出突起,形态似神经元样细胞且表达Nestin和NSE抗体,Nestin的表达时相早于NSE且表达强度高于NSE(P<0.05)。在药物作用1 h后,BMSCs细胞Cyclin D1不论在基因转录水平还是在蛋白表达水平均出现大幅度下调,此时BMSCs开始有Nestin的表达;药物作用12、24 h,BMSCs细胞Cyclin D1表达与药物作用前表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论:黄芪甲苷可能首先通过调整细胞周期,延长了G1期向S期转变的时间,从而启动了BMSCs的分化程序,诱导BMSCs向神经干细胞分化。在黄芪甲苷的营养作用下,细胞的突起进一步生长并向神经元分化。

抑制PPARγ表达对BMSCs成骨分化的影响

目的探究抑制过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)表达对BMSCs成骨分化的影响,为原发性骨质疏松症(primary psteoporosis,POP)的治疗提供理论基础。方法将骨密度正常患者提取的BMSCs分为正常对照组(CON组),POP患者提取的BMSCs分为原发性骨质疏松组(POP组),取POP组细胞加入PPARγ抑制剂,分为抑制剂组(INR组),经成骨诱导分化后,检测各组细胞中骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Osterix、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达情况;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色观察各组BMSCs成骨分化情况。结果POP组ALP阳性细胞数低于CON组和INR组(P<0.05);与CON组相比,POP组中OCN、OPN、Osterix、Runx2表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与POP组相比,INR组中OCN、OPN、Osterix、Runx2表达量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论抑制PPARγ表达后,BMSCs成骨分化特异性基因(ALP、OCN、OPN、Osterix、Runx2)表达增加。

仿生聚乳酸纤维膜对大鼠BMSCs成骨分化的影响

目的:探讨微观形貌仿生的聚乳酸纤维膜对大鼠BMSCs生长、铺展、黏附、增殖和成骨分化的影响。方法:取第3代rBMSCs,按1×105个/mL密度接种于覆盖不同直径聚乳酸纤维膜的细胞培养板上,分别为仿生组(A组)直径(357±32)nm、有形貌对照组(B、C组)直径分别为(164±13)nm、(1311±93)nm,无形貌空白对照组(Ctrl组),在成骨分化实验时增设成骨诱导阳性对照组(Positive组)。扫描电镜观察BMSCs生长、铺展;CCK-8试剂盒检测BMSCs增殖、黏附;实时荧光定量PCR检测Runx2、COLI、ALP、OSX的mRNA表达;Western Blot检测骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OC)的表达。结果:扫描电镜示:A、B二组上细胞具有明显聚集区域,相互联系紧密;单个细胞形态观察,A组较B、C及Ctrl组,细胞铺展面积更大、伪足更多。黏附实验示:在8h、16h,A、B组均高于C组(P<0.05)。增殖实验示:第3、5、7、9天,Ctrl组、A组、B组增殖情况均优于C组(P<0.05),三组间对比,Ctrl组优于A、B组(P<0.05);第7、9天A组增殖情况优于B组(P<0.05)。实时荧光定量PCR显示:在第3、10天,A、Positive组ALP、COLI、Runx2、OSX的mRNA表达量均明显高于B、C及Ctrl组(P<0.05);A组低于Positive组(P<0.05)。蛋白质印迹示:第10天,A、Positive组OPN、OC表达量均明显高于B、C、Ctrl组(P<0.05);A组OC表达量低于Positive组(P<0.05);B、C、Ctrl三组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:微观形貌仿生的聚乳酸纤维膜能促进rBMSCs黏附、增殖、成骨分化。

基于BMSCs淫羊藿-仙茅-巴戟天角药抗骨质疏松药效物质提取工艺研究

目的筛选淫羊藿-仙茅-巴戟天角药抗骨质疏松药效物质的最佳提取工艺。方法采用正交设计,选取提取时间、料液比、乙醇浓度为考察因素,以BMSCs细胞增殖率结合淫羊藿苷、总黄酮含量为考察指标,筛选淫羊藿-仙茅-巴戟天角药抗骨质疏松药效物质的最佳提取工艺,并对最佳提取条件进行验证。结果兼顾生产效率和节约能源,优选出淫羊藿-仙茅-巴戟天角药药效物质的最佳提取条件为提取时间1.5 h,乙醇浓度55%,溶剂用量10倍。验证实验结果BMSCs细胞增殖率、淫羊藿苷及总黄酮含量与工艺考察结果非常接近。结论该方法在保证淫羊藿-仙茅-巴戟天角药治疗骨质疏松的药效基础上,结合淫羊藿苷及总黄酮含量进行综合评价,优化提取工艺,使得实验结果更科学合理。

炎性微环境下TGF-β1通过TGF-β1/Smad3通路促进BMSCs成骨分化

目的研究炎性微环境下转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及作用机制。方法应用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)体外模拟炎性微环境,检测不同浓度TGF-β1对BMSC增殖活性的影响。实验分为对照组[BMSC+成骨诱导液(osteogenic medium,OM)]、实验组(BMSC+TGF-β1+OM)和抑制组[BMSC+SB431542(TGF-β1拮抗剂)+OM]。应用ALP染色、茜素红染色、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)及Western blot法对BMSCs成骨分化能力和TGF-β信号通路因子Smad2、Smad3进行检测并比较3组间的差异。结果低浓度TGF-β1作用下BMSCs增殖活性较高,高浓度(50ng/ml)抑制BMSCs增殖活性;成骨诱导7天和10天时,实验组与其他两组比较,ALP染色较深、面积最大;茜素红染色结果显示,实验组体外矿化结节形成均高于其他两组;RT-qPCR检测结果显示,实验组成骨分化基因OPN、RUNX2与ALP表达均增高,TGF-β信号通路中Smad3在实验组表达最高,抑制组表达最低,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot法检测结果显示,实验组内OPN、RUNX2与ALP蛋白表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β信号通路中Smad3蛋白表达在3组中差异不明显,而p-Smad3在实验组中表达明显增高、抑制组中明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论炎性微环境中TGF-β1通过激活TGF-β/Smad3信号通路促进了BMSCs成骨分化。

基于SDF-1/CXCR4轴探讨补肾壮筋汤促进小鼠BMSCs归巢和保护关节软骨的机制研究

目的探讨补肾壮筋汤调控SDF-1/CXCR4轴促进小鼠BMSCs归巢和保护关节软骨的作用机制,为膝骨关节炎(KOA)的康复治疗提供实验依据。方法①动物实验中,选用8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠30只,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、补肾壮筋汤组,每组10只,干预12周。采用micro-CT、HE染色观察各组软骨形态变化;激光共聚焦显微镜观察骨组织SDF-1荧光强度;qPCR、Western blot检测各组归巢相关调控因子mRNA转录水平和蛋白相对表达量。②细胞实验中,选用4周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,采用全骨髓贴壁法提取原代BMSCs,流式细胞术对所提取的细胞进行鉴定后,筛选最佳慢病毒MOI值;随机将细胞分为空白组、空载组、补肾壮筋汤组、sh-SDF-1组、sh-SDF-1+补肾壮筋汤组5组,采用划痕实验观察各组BMSCs迁移情况;阿利新蓝、CollagenⅡ免疫细胞学染色观察各组细胞成软骨分化能力;激光共聚焦显微镜观察各组SDF-1、CXCR4的荧光强度;qPCR检测各组归巢相关调控因子mRNA转录水平。结果①动物实验中,关节组织形态学结果(micro-CT、HE染色)显示:与假手术组比较,模型组股骨髁间可见一圆形缺损,骨皮质失连,软骨细胞缺失;与模型组比较,补肾壮筋汤组股骨髁间环形缺损好转,软骨细胞排列稍紊乱。关节组织免疫荧光显示:与假手术组比较,模型组SDF-1蛋白相对表达量升高;与模型组比较,补肾壮筋汤组SDF-1的蛋白相对表达量升高(P<0.05)。qPCR与Western blot结果显示:与假手术组比较,模型组归巢关键调控因子(SDF-1、CXCR4、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β、RANTES、VEGF、G-CSF、NCAM-1、MMP-2)的mRNA转录水平和蛋白相对表达量升高(P<0.05);与模型组比较,补肾壮筋汤组归巢关键调控因子mRNA转录水平和蛋白相对表达量升高(P<0.05)。②细胞实验中,BMSCs经细胞流式术鉴定:CD44、CD105呈阳性表达,CD34呈阴性表达。当病毒MOI值为100时,SDF-1基因感染率最高。BMSCs迁移和成软骨分化能力检测结果显示:与空白组比较,sh-SDF-1组细胞向划痕区域迁移的细胞数量、酸性黏多糖及CollagenⅡ蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);补肾壮筋汤组和sh-SDF-1+补肾壮筋汤组迁移的细胞数量、阿利新蓝染色及CollagenⅡ蛋白相对表达量显著增多(P<0.05)。细胞免疫荧光显示:与空白组比较,sh-SDF-1组细胞SDF-1、CXCR4蛋白相对表达量显著减少;补肾壮筋汤组和sh-SDF-1+补肾壮筋汤组细胞SDF-1、CXCR4蛋白相对表达量显著增多(P<0.05)。qPCR结果显示:与空白组比较,sh-SDF-1组归巢关键调控因子的mRNA转录水平降低(P<0.05),补肾壮筋汤组归巢关键调控因子的mRNA转录水平升高(P<0.05)。结论补肾壮筋汤可通过上调SDF-1/CXCR4轴促进小鼠BMSCs归巢保护关节软骨。

BMSCs对骨质疏松性骨折模型大鼠的影响及作用机制

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对骨质疏松性骨折模型大鼠的影响及作用机制。方法将48只雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、骨质疏松性骨折组、BMSCs处理的骨质疏松性骨折组,比较骨生物力学变化情况及骨密度和骨超声振幅衰减程度;同时测量椎体骨组织形态学指标:骨小梁体积百分比、骨小梁表面百分比、骨小梁平均宽度、矿化沉积率;酶联免疫吸附试验测定血清骨碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原交联C-末端肽水平。结果骨质疏松性骨折组右侧股骨和L5椎体的弹性模量、最大载荷明显低于假手术组,BMSCs处理的骨质疏松性骨折组上述指标荷明显高于骨质疏松组(P<0.05)。骨质疏松性骨折组骨密度、超声衰减程度明显低于假手术组,BMSCs处理的骨质疏松性骨折组上述指标明显高于骨质疏松性骨折组(P<0.05)。骨质疏松性骨折组骨小梁体积百分比、骨小梁平均宽度明显低于假手术组,骨小梁表面百分比、矿化沉积率明显高于假手术组(P<0.05);BMSCs处理的骨质疏松性骨折组骨小梁体积百分比、骨小梁平均宽度明显高于骨质疏松性骨折组,骨小梁表面百分比、矿化沉积率明显低于假手术组(P<0.05)。骨质疏松性骨折组血清骨碱性磷酸酶明显低于假手术组,Ⅰ型胶原交联C-末端肽水平明显高于假手术组(P<0.01);BMSCs处理的骨质疏松性骨折组血清骨碱性磷酸酶明显高于假手术组,Ⅰ型胶原交联C-末端肽水平明显低于假手术组(P<0.01)。结论BMSCs能够明显改善骨质疏松性骨折模型大鼠的骨生物力学和骨组织形态学指标,提升骨密度,可能与上调骨碱性磷酸酶表达、下调Ⅰ型胶原交联C-末端肽表达有关。

中医药调控BMSCs成骨分化防治骨质疏松症的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化与成脂分化不平衡是导致骨质疏松症(OP)的主要原因之一,故在治疗OP方面,调控BMSCs的增殖、分化已成为重要手段。大量研究显示中药及其复方可以通过调节相关基因及通路的表达诱导BMSCs增殖、迁移及成骨分化,从而达到防治骨质疏松症的目的。近年来,中医药在防治OP方面的优势不断扩大。故本文结合中药及其复方调控BMSCs成骨分化防治OP的医学研究,为中医药防治OP提供相关依据。

GH/IGF-1系统在BMSCs成脂分化过程中作用机制的实验研究

目的研究温肾健脾、活血化瘀含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化作用过程中生长激素(GH)/胰岛素样生长因子1(IGF-1)系统的调节机制。方法将40只SPF级雄性SD大鼠用随机数字表法分成4组,依次为正常组、成脂诱导组、温肾健脾组、活血化瘀组。对大鼠进行7 d灌胃,制备含药血清,按一定比例将含药血清与完全培养基进行配比用以BMSCs成脂分化的培养。油红O染色观察BMSCs成脂分化情况后,用ELISA法测定脂肪细胞中GH、IGF-1的蛋白水平。结果GH蛋白表达水平结果:与正常组比较,成脂诱导组低于正常组,差异不具有统计学意义(P>0.05)。与成脂诱导组相比,温肾健脾组、活血化瘀组结果均优于成脂诱导组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。温肾健脾组与活血化瘀组相比,活血化瘀组结果优于温肾健脾组。②IGF-1蛋白表达水平结果:与正常组相比,成脂诱导组结果高于正常组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。与成脂诱导组相比,温肾健脾组、活血化瘀组结果均低于成脂诱导组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。温肾健脾组、活血化瘀组相比,活血化瘀组结果高于温肾健脾组。结论温肾健脾、活血化瘀中药可能通过GH/IGF-1系统发挥抑制BMSCs的成脂分化作用。

LncRNA与miRNA的相互作用调控BMSCs谱系分化的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨与成脂分化失衡是导致骨质疏松症(OP)的主要原因之一,在治疗骨质疏松症方面,调控BMSCs的谱系分化已成为当前主要手段。随着生物学研究的不断深入,长链非编码蛋白RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)均广泛参与调控BMSCs谱系分化的过程。大多数miRNA可作为内源性竞争性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)调控lncRNA的表达进程,许多lncRNA还充当miRNA的ceRNA以调节影响不同途径的miRNA靶向基因的表达。二者之间的相互作用对于调控BMSCs谱系分化有着更为明显的优势,故本文围绕其进行综述,为临床治疗骨质疏松症寻找新的理论和实验依据。

BMSCs介导STAT3对脑出血大鼠海马组织eIF2α、Glu表达水平的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脑出血(ICH)大鼠海马组织真核细胞翻译起始因子2α亚基(eIF2α)、谷氨酸(Glu)表达水平的影响及其机制。方法100只SD大鼠,随机选取10只分离BMSCs,剩余90只采用Ⅳ型胶原酶构建ICH模型。90只大鼠随机分为假手术组、ICH组和BMSCs移植组,每组30只。造模成功后24h,BMSCs移植组大鼠经尾静脉注入BMSCs,其余2组注入等体积0.9%氯化钠溶液。观察大鼠一般情况,评估神经功能,测定脑组织含水量。蛋白印迹测定海马组织内质网应激相关因子、eIF2α及JAK/STAT3通路蛋白水平,高效液相色谱法测定Glu浓度,TUNEL法分析细胞凋亡情况。结果ICH组大鼠神经功能缺损评分(NSS)和脑组织含水量显著大于假手术组,海马组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)蛋白相对表达量显著低于假手术组,CAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和Caspase-12蛋白相对表达量显著高于假手术组,海马组织eIF2α蛋白相对表达量和Glu水平显著高于假手术组,海马神经细胞凋亡率显著高于假手术组,海马组织JAK、p-JAK、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达量显著低于假手术组(P<0.05);与ICH组比较,BMSCs移植组大鼠NSS评分和脑组织含水量显著降低,海马组织GRP78蛋白相对表达量显著增加,CHOP和Caspase-12蛋白相对表达量显著降低,eIF2α蛋白相对表达量和Glu水平显著降低,海马神经细胞凋亡率显著降低,海马组织JAK、p-JAK、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达量显著增加(P<0.05)。结论BMSCs移植可通过JAK/STAT3通路降低ICH大鼠海马组织eIF2α和Glu表达,抑制神经细胞凋亡,减轻内质网应激,从而达到减轻脑损伤,改善神经功能作用。

BMSCs外泌体来源miR-133a对大鼠脊髓损伤修复的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体来源miR-133a对大鼠脊髓损伤(SCI)修复的影响。方法原代分离和培养BMSCs,测定BMSCs细胞表面标记物(CD90,CD45)表达;提取BMSCs外泌体,观察外泌体形态及外泌体标记分子(Alix、CD63)表达;建立SCI大鼠模型,随机将大鼠分为假手术组、SCI组、外泌体组、外泌体-抑制剂对照(NC)组、外泌体-miR-133a抑制剂组,28 d后,对各组大鼠进行BBB评分评估脊髓损伤程度;分离大鼠骨髓组织,检测该组织病理学变化、细胞凋亡状况;同时检测相关蛋白[胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元核抗原(NeuN)、炎性小体3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)-1]及miR-133a表达水平。双荧光素酶实验验证miR-133a、NLRP3靶向关系。结果BMSCs细胞中CD90、CD45表达率分别为98.07%、0.09%。外泌体呈球形,Alix、CD63呈阳性表达。与假手术组比较,SCI组BBB评分、NeuN、miR-133a表达显著降低,细胞凋亡率、GFAP、NLRP3、caspase-1表达显著增加(P<0.05);与SCI组比较,外泌体组BBB评分、NeuN、miR-133a表达显著增加,细胞凋亡率、GFAP、NLRP3、caspase-1表达显著降低(P<0.05);抑制miR-133a表达逆转了外泌体对SCI大鼠的修复作用(P<0.05)。结论BMSCs外泌体来源miR-133a,可对SCI大鼠起到修复作用。

TGF-β_1和IGF-1共同转染大鼠BMSCs向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨应用TGF-β1和IGF-1基因转染大鼠BMSCs后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果,为构建新型的组织工程软骨种子细胞提供思路。方法6周龄健康雄性Wistar大鼠2只,体重约150g。扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,酶切、电泳鉴定并测序。采用密度梯度离心法和贴壁分离法,分离、纯化Wistar大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察原代和传代BMSCs形态学改变,免疫荧光法检测细胞表面标志。将TGF-β1和IGF-1基因单独或共转染第3代BMSCs,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染TGF-β1组(C组)、转染IGF-1组(D组)、TGF-β1与IGF-1共转染组(E组)。对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达。结果电泳显示IGF-1和TGF-β1两目的基因条带,基因测序与Gene-Bank cDNA序列相符。大鼠BMSCs原代细胞接种24h后可见少量贴壁突起细胞,4、5d开始形成典型的BMSCs簇状增生,9、10d细胞生长即可达80%～90%融合;传代后细胞形态较均一。免疫荧光法检测BMSCs的CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应。转染24h后有少量细胞死亡,筛选3周后细胞克隆形成,至第4周细胞可传代,多数细胞变成多边形,部分细胞边界不清,呈圆形,核偏位,核周颗粒明显。MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490nm波长处的吸光度(A)值,分别为0.432±0.038、0.428±0.041、0.664±0.086、0.655±0.045和0.833±0.103。A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P<0.01),但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR和Western blot检测目的基因和蛋白的表达量,TGF-β1表达以C组最多,分别为0.9250±0.0220、124.3417±2.9820,E组次之,分别为0.7717±0.0120、101.7667±1.2410(P<0.01);IGF-1表达以E组最多,分别为1.0200±0.0260、128.1717±9.1520,D组次之,分别为0.4650±0.0420、111.0450±6.2480(P<0.01);II型胶原表达以E组最多,分别为0.9800±0.0340、120.3550±12.5500,C组次之,分别为0.7200±0.0260、72.2467±7.3640(P<0.01)。结论通过TGF-β1和IGF-1基因共同转染BMSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向,对组织工程软骨应用于临床具有重要意义。

辛伐他汀联合BMSCs治疗激素性股骨头坏死的实验研究

目的单纯BMSCs治疗激素性股骨头坏死的效果尚不理想,探讨辛伐他汀联合BMSCs治疗激素性股骨头坏死的可行性。方法取24只新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs,取第2代细胞制备为1×107/mL细胞悬液,与明胶海绵复合。取70只新西兰大白兔经耳缘静脉注射10μg/kg脂多糖,24h后臀肌注射20mg/kg甲基强的松龙琥珀酸钠,共3次,每次间隔24h,制备股骨头坏死模型。选取制备成功的48只,随机分为4组,每组12只。A组:不作任何处理;B组:单纯减压,并于减压通道植入明胶海绵;C组:减压同时植入复合BMSCs的明胶海绵;D组:减压同时植入复合BMSCs的明胶海绵,每日灌服辛伐他汀(10mg/kg)至处死。观察动物一般情况,于术后4、8周各组取6只行MRI扫描后,处死取股骨头行组织学及免疫组织化学染色,扫描电镜观察。结果术后8周C、D组动物走路姿势逐步好转。术后4周各组MRI未见明显坏死区信号改变,8周时A组可见坏死低信号区明显扩大,B组无变化,C组范围缩小,D组明显缩小。组织病理学观察,术后4周A组见空骨陷窝,无新生毛细血管;B组空骨陷窝较多,有少量新生毛细血管;C、D组空骨陷窝减少,坏死区有大量增生活跃的成骨细胞及新生毛细血管。D组空骨陷窝阳性数及微血管密度分别为19.30±1.52和7.08±1.09,与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后8周,A组可见部分骨小梁断裂;B组减压孔道有纤维性骨痂形成;C组空骨陷窝少见,髓腔形态不规则;D组大量新生骨形成,髓腔较规则,髓内脂肪细胞大小及分布均匀。D组空骨陷窝阳性数及微血管密度分别为11.31±1.28和12.37±1.32,与其他组比较差异有统计学意义(P<0.05),与术后4周比较差异有统计学意义(P<0.05)。扫描电镜观察:术后8周,A组骨小梁见多处断裂塌陷,骨小梁表面未见骨细胞,髓腔内有大量脂肪细胞堆积;B组部分骨小梁可见裂痕;C组骨小梁不致密;D组骨小梁结构规整致密,成骨细胞多,骨细胞及基质胶原纤维正常,髓腔规则。结论辛伐他汀能促进BMSCs成骨及成血管化,辛伐他汀联合BMSCs治疗激素性股骨头坏死具有较好的应用前景。

BMSCs成骨分化的干预效应血小板裂解液对大鼠

目的观察血小板裂解液(platelet lysate,PL)对大鼠BMSCs成骨诱导分化的干预效应。方法成年健康清洁级Wistar大鼠24只,体重250～300 g,雌雄不限。取16只大鼠心内采血,采用3次离心结合反复冻融法制备PL,ELISA法测定PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量。另取8只大鼠,采用全骨髓分离培养法扩增传代BM SCs,取第4代细胞按1×104/cm2接种行成骨诱导培养。按诱导培养液的不同,实验分为3组,A、B组基础诱导培养基中分别含终浓度为5%和1%的PL,C组仅含基础诱导培养基。倒置相差显微镜动态观察各组细胞形态变化及生长状况;诱导培养7 d,各组行ALP染色;诱导培养2、8、10 d,ALP/总蛋白含量确定ALP活性;诱导培养20 d,茜素红染色观察矿化结节形成并定量分析。结果PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量分别为(300±30)、(140±25)、(80±35)和(70±20)pg/mL。倒置相差显微镜观察,各组BMSCs形态逐渐发生改变,出现类成骨细胞样形态特征;A组细胞形态变化不及B、C组明显,但细胞增殖较快;20 d A组细胞仍密集生长,ECM中形成的矿物沉积显著少于B、C组。诱导培养7 d,A组细胞胞浆中有少量颗粒,ALP染色呈弱阳性;B、C组细胞胞浆中有大量棕褐色颗粒,ALP染色呈强阳性。诱导培养2、8、10 d,ALP活性定量分析示A组显著低于B组和C组(P<0.05)。诱导培养20 d,茜素红染色显示A、B、C组钙结节数量分别为(7.67±1.10)、(12.87±0.81)和(15.59±1.25)个;矿化结节面积分别为(161 778.70±44 550.80)、(337 349.70±56 083.24)和(415 921.70±71 725.39)像素;A组均明显低于B组和C组(P<0.05),B、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论PL是多种生长因子的承载体系,以剂量依赖方式抑制BMSCs成骨诱导中ALP活性和矿化结节形成。

HA复合rhBMP-2转染的BMSCs对羊胫骨延长骨愈合的影响

目的评价HA复合rhBMP-2的腺病毒(adenovirus mediated rhBMP-2,Adv-rhBMP-2)转染的羊BMSCs对骨痂延长骨愈合的影响。方法成年山羊19只,雌雄不限,体重15～20kg。于每只羊髂嵴上穿刺抽取骨髓10mL,常规传代培养BMSCs。取第3代BMSCs,以感染复数200转染腺病毒。取0.25%胰蛋白酶消化转染后3d的细胞1×108个,与HA充分混匀制备Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA。建立山羊右侧胫骨延长模型,术后立即于截骨部位注射自体细胞复合物。按术后注入物质不同随机分成4组:A组为Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA组(n=6),B组为Adv-rhBMP-2/BMSCs组(n=5),C组为Adv-β-gal/BMSCs/HA组(n=4),D组为空白组(n=4)。术后第7天开始行胫骨延长,速度1mm/d,共延长4周。术后5、8、12周摄X线片观察骨痂生长情况,12周处死动物,取标本分别行骨密度检测、生物力学测定、组织学观察和骨形态计量学分析。结果X线片检查示,术后5、8周A、B组骨痂生成量明显多于C、D组,X线片定量评分A、B组明显高于C、D组,差异均有统计学意义(P<0.05);12周各组均在骨延长部位形成连续骨痂。骨密度测定:术后12周A、B、C、D组延长部位骨矿物质含量分别为(4.175±1.921)、(2.600±0.638)、(2.425±0.826)和(1.175±0.574)?g,骨矿物质密度分别为(0.612±0.196)、(0.630±0.159)、(0.450±0.166)和(0.266±0.113)g/cm2,A、B组显著高于C、D组(P<0.05)。生物力学测定:A、B、C、D组最大载荷分别为(490.20±155.08)、(350.59±80.48)、(221.95±68.79)和(150.65±92.29)N,弹性模量为(178.24±105.80)、(105.88±27.09)、(81.18±48.67)和(50.35±47.64)MPa,各指标A组显著高于C、D组(P<0.05)。组织学观察见A组骨延长处大量新生骨组织,骨小梁多为纵行网状排列。骨形态计量分析示A、B、C、D组新骨体积分别为72.35%±5.68%、67.58%±7.42%、49.63%±4.87%和38.87%±2.35%,A组新生骨生成量明显比D组多(P<0.05)。结论HA复合rhBMP-2修饰的BMSCs制备的组织工程骨可促进羊胫骨延长骨愈合。

杜仲叶通过Shp2激活Erk1/2促进BMSCs增殖的研究

目的研究杜仲叶提取物对大鼠BMSCs的增殖作用及其分子机制。方法使用密度梯度离心和贴壁培养法从SD大鼠股骨骨髓中获取BMSCs,通过流式细胞仪检测细胞表面抗原;分别用0,5,20,60,100 mg/ml的杜仲叶提取物和20mg/ml杜仲叶提取物+10μmol/L Shp2抑制剂NSC87887处理BMSCs,2 d后BrdU检测细胞增殖情况;用无血清无酚红培养基饥饿大鼠BMSCs 6 h后,一组分别加入0,5,20,60,100 mg/ml的杜仲叶提取物处理15 min,另一组用10μmol/LShp2抑制剂处理预处理2 h后加入20 mg/ml杜仲叶提取物处理15 min,Western blot检测p-Shp2(Tyr580)和Erk1/2磷酸化水平的变化。结果流式细胞仪细胞表面抗原检测显示CD29、CD90呈阳性,CD34、CD45呈阴性;BrdU结果显示杜仲叶提取物促进BMSCs增殖,并具有浓度依赖性,NSC87887可以抑制其促进作用;杜仲叶提取物可以诱导BMSCs的p-Shp2(Tyr580)和Erk1/2磷酸化水平升高,而对诱导Erk1/2磷酸化的促进作用是通过激活Shp2来完成的。结论杜仲叶提取物通过Shp2/Erk途径促进大鼠BMSCs增殖。

间歇性负压培养对人BMSCs骨保护素和骨保护素配体mRNA表达水平的影响

目的探讨间歇性负压对体外培养的人BMSCs骨保护素(osteoprotegerin,OPG)mRNA和骨保护素配体(osteoprotegerin ligand,OPGL)mRNA表达水平的影响。方法2008年1月由2例髋关节骨性关节炎行人工关节置换患者自愿捐赠骨髓,分离并体外培养人BMSCs,取第3代细胞。实验组进行负压诱导,设置压力为50kPa,30min/次,2次/d,间歇性负压干预2周;对照组于普通CO2培养箱中常规培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态,并通过实时定量PCR检测OPG mRNA和OPGL mRNA表达水平。结果实验组细胞增殖速度略低于对照组,细胞逐渐由梭形向多角形转变,有数个突起,数目和形态不定,10～14d细胞融合成单层,2周后逐渐形成多个散在致密岛状结构;对照组细胞大部分为梭形。间歇性负压培养2周后,与对照组比较,实验组细胞OPG mRNA表达水平显著提高,OPGL mRNA表达水平显著降低,OPGL mRNA与OPG mRNA比率显著下降,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论间歇性负压促进人BMSCs OPG表达,同时抑制其OPGL表达。

CdCl_2诱导大鼠BMSCs凋亡和DNA损伤的研究

目的研究化学毒性物质氯化镉（cadmium chloride,CdCl2）对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）形态学、MTT检测结果、细胞凋亡及DNA稳定性的影响。方法用MTT法筛选CdCl2对BMSCs抑制作用的最佳浓度;将BMSCs（F3）分为对照组及CdCl2最佳浓度（200μmol/L）干预组,培养24 h后用MTT法检测BMSCs的生存情况,用流式细胞仪（flow-cytometer,FCM）检测细胞凋亡情况,用单细胞凝胶电泳技术（SCGE）检测BMSCs的DNA损伤情况。结果 CdCl2可对BMSCs在6.25~200μmol/L有明显的抑制作用,细胞给药12及24 h后,存在剂量-效应关系和时间-效应关系,CdCl2对BMSCs抑制作用最强的浓度为200μmol/L（24 h）;显微镜下观察,对照组细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,胞体透亮,折光性强;CdCl2诱导组细胞呈凸起回缩,细胞变小、变圆,贴壁不牢,悬浮细胞增多;与对照组比较,CdCl2诱导组细胞存活率明显降低,细胞凋亡明显增加,细胞的DNA拖尾率、平均尾长显著增加（P〈0.01）。结论 CdCl2在质量浓度为6.25~200μmol/L时对BMSCs有明显的抑制作用;对BMSCs抑制作用最强的浓度为200μmol/L（24 h）,且可引起大鼠BMSCs凋亡及DNA的损伤。

补肾方药诱导BMSCs移植对脑缺血损伤NGF、BDNF、VEGF表达的影响

目的观察补肾方药血清诱导大鼠BMSCs移植对脑缺血损伤大鼠脑组织神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达水平的影响作用。方法用线栓法制备大脑中动脉闭塞模型,随机分为模型组,单纯BMSCs移植组,左归丸、右归丸、地黄饮子、维甲酸诱导BMSCs移植组,另设假手术对照组。尾静脉移植用不同药物血清孵育BMSCs,移植后3 d和7 d处死大鼠,用ELISA法检测脑组织匀浆上清液中NGF、BDNF、VEGF的含量。结果第3天,与假手术组比较,模型组BDNF明显升高(P<0.05);与模型组比较,BMSCs移植各组VEGF明显升高(P<0.01),且药物孵育BMSCs移植各组NGF、BDNF明显升高(P<0.05,P<0.01);第7天,与假手术组比较,模型组NGF、BDNF明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,BMSCs移植各组NGF、BDNF、VEGF明显升高(P<0.01);与右归丸组比较,左归丸、地黄饮子组NGF、BDNF明显升高(P<0.01)。结论不同补肾法方药血清孵育BMSCs均可促进脑缺血损伤大鼠脑组织匀浆上清液中NGF、BDNF、VEGF的表达,且补阴和阴阳双补方药诱导BMSCs组中表达的NGF、BDNF作用优于补阳类方药。