重组BPI_(23)-Fcγ1融合蛋白在CHO细胞中的表达

The fusion gene of BPI 23 and human Fcγ1 was obtained by PCR method,and the expression plasmid was constructed to express recombinant BPI 23 \|Fcγ1 fusion protein in CHO cells.After transfection with the plasmid and selection by methotrexate,the cell lines expressing the fusion protein were obtained.The recombinant protein was purified using cation\|exchange chromatography and its bioactivity was proved with bactericidal assays.

猪BPI基因部分cSNPs检测及其对蛋白结构功能的影响

本试验以98头苏太猪为研究对象,检测BPI基因部分编码区的单核苷酸多态性(SNPs),并预测分析碱基突变对BPI蛋白结构和功能的影响。利用PCR-SSCP和PCR-RFLP结合测序的方法检测BPI基因外显子1、4和10的SNPs,运用生物信息学比较分析原蛋白和突变型蛋白的理化性质和结构。结果表明,以BPI基因cDNA序列作为参照,BPI外显子1、4和10存在6个SNPs,3个同义突变(c.24A>G、c.54T>C和c.522C>T)和3个错义突变(c.433C>T(Arg145Trp)、c.1060A>G(Thr354Ala)和c.1151T>G(Leu384Arg))。3种错义突变未改变BPI蛋白的理化性质、信号肽、跨膜区、糖基化位点以及二、三级结构,但是导致磷酸化位点的改变或存在其他潜在功能位点区域。Western blot试验发现,BPI蛋白的分子量为53ku,苏太猪F18大肠杆菌抗性型猪的BPI蛋白表达量显著高于敏感型猪。猪BPI外显子4和10的碱基突变不同程度影响到蛋白功能,并可能对机体疾病的抗性/易感性产生影响。

BPI_(m23)重组抗菌蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的 :采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达分泌型功能性rBPIm2 3抗菌蛋白。方法 :利用构建的pUC1 8 synBPI4 1 4质粒和PBV2 2 0 BPIm4 2 0 质粒 ,按分子克隆方法构建pPICZα synBPIm6 0 0 重组表达载体 ;用线性化pPICZα synBPIm6 0 0 质粒电转化PichiapastorisGS1 1 5 ,筛选抗性转化子 ,进行PCR和Mut表型鉴定 ;用甲醇诱导目的蛋白rBPIm2 3的表达 ;用离子交换层析纯化rBPIm2 3,并进行SDS PAGE分析、Westernblot鉴定和用BCA法定量。结果 :①成功构建了pPICZα synBPIm6 0 0 重组表达载体 ;②获得稳定整合目的基因的GS1 1 5菌株 ;③表达产物相对分子量约为 2 3kD ,可与抗BPI抗体特异性结合 ;④培养上清液中目的蛋白表达量约为 2 9mg L。结论 :BPIm2 3重组抗菌蛋白在毕赤酵母GS1 1 5中得到分泌表达。

猪BPI蛋白重组载体的构建及真核表达

试验旨在构建猪BPI真核表达载体,获得猪源BPI重组蛋白。根据GenScript’s CloneEZ?PCR Cloning Kit试剂盒,将BPI编码序列克隆至pUC57载体上,酶切与测序鉴定无误后,将重组质粒pUC57-BPI转染293-6E细胞,并利用SDS-PAGE和Western blotting方法检测其表达水平。结果显示,本试验成功构建了猪源BPI蛋白真核表达载体pUC57-BPI,并在293-6E细胞培养上清中检测到猪源BPI重组蛋白的表达。该猪源BPI重组蛋白体外表达系统的建立为今后深入研究猪BPI的生物学功能以及猪抗菌蛋白的制备提供了试验基础。

pPICZα-synBPI_(m600)酵母表达载体的构建和鉴定

为使rBPIm2 3 重组抗菌蛋白在毕赤酵母表达系统中分泌表达 ,拟构建synBPIm60 0 酵母表达载体。以pUC18 synBPI41 4 质粒为模板扩增synBPI2 0 0 基因片段 ,经XhoI/EcoRI双酶切获得synBPI1 85bp基因片段 ;EcoRI/SalI双酶切PBV2 2 0 BPIm60 0 质粒获得BPIm42 0 基因片段 ;将上述 2个基因片段连接后定向克隆到pPICZα酵母表达载体上。连接产物转化E .coliTOP 10F′ ,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子。阳性克隆菌经菌落PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定 ,结果与预期相符。提示 :成功构建了pPICZα synBPIm60 0

新疆巴什拜羊BPI基因cDNA全长的克隆及序列分析

【目的】克隆巴什拜羊杀菌/通透性增强蛋白(BPI)的cDNA序列,为研究该蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到中性粒细胞后提取RNA。根据GenBank中牛BPI基因的cDNA序列设计兼并引物,用RT-PCR方法扩增巴什拜羊BPI基因部分序列,再根据已知的巴什拜羊BPI基因部分序列设计RACE引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,分别回收克隆的目的基因片段,再与pMD18-T载体连接,分别转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后进行拼接,获得巴什拜羊BPI基因全长cDNA序列,并对序列进行分析。【结果】克隆的巴什拜羊BPI基因cDNA序列全长1 922bp,其中开放阅读框为1 452bp,共编码483个氨基酸;BLAST分析表明,巴什拜羊BPI基因的核苷酸序列与绵羊、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾核苷酸的一致性分别为99%,91%,78%,74%,64%,61%,58%,53%和50%;氨基酸进化分析显示,巴什拜羊首先与绵羊聚为一类,其次与牛聚为一类,该聚类分析结果与生物学分类结果表现一致。【结论】通过RACE方法成功地克隆了1 922bp的巴什拜羊BPI基因cDNA全长序列,且基因进化树聚类结果与生物学分类结果相一致。

BPI基因生物信息学分析及其在不同猪群体中的遗传变异情况

【目的】明确猪杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)基因中可能存在的SNP位点,并探讨BPI基因外显子10在上海地区5个猪群体中的多态性及其与抗病相关的优势基因型,为揭示BPI基因在仔猪腹泻抗病机制中的作用及开展猪抗病育种提供理论依据。【方法】采用在线生物信息学软件分别从碱基序列、SNP位点和蛋白氨基酸序列等角度比对分析猪BPI基因全长cDNA序列与电子克隆序列的差异,采用PCR-RFLP检测分析猪BPI基因外显子10的多态性,并检测BPI基因外显子10在杜洛克、长白、大白、申农和梅山猪群体中的基因型及基因频率。【结果】猪BPI基因电子克隆编码区(CDS)序列长度1452 bp,编码483个氨基酸,存在44个SNP位点,其中22个为同义SNP位点、22个为非同义SNP位点。猪BPI基因全长cDNA序列(EF436278.1和FJ810853.1)与电子克隆序列相比存在14处碱基差异,而对应的翻译蛋白序列存在4处氨基酸差异。猪BPI基因外显子10存在AA、BB和AB 3种基因型,各基因型在杜洛克猪、长白猪、大白猪、申农猪和梅山猪群体中的分布情况各不相同。在杜洛克猪群体中AA基因型和AB基因型呈中度多态分布(0.404和0.416),BB基因型检出比例较低(0.180);在长白猪和申农猪群体中均未检测出AA基因型,BB基因型检出比例较高,而AB基因型检出比例较低;在大白猪和梅山猪群体中均以BB基因型检出比例较高,AB基因型次之,AA基因型检出比例最低。总体来看,除了杜洛克猪群体的A等位基因频率较高外,其他4个猪群体均以B等位基因频率较高。【结论】猪BPI基因外显子10 AA基因型频率在杜洛克猪群体中最高,在大白猪和梅山群体中较低,在长白猪和申农猪群体中未检出,即AA基因型在杜洛克猪群体中比例高与其仔猪腹泻发病率低的情况一致。因此,在大白猪和梅山猪育种过程中需提高AA基因型比例,而在长白猪和申农猪育种过程中需引进AA基因型个体,降低BB和AB基因型比例,以增加仔猪的抗病能力。

补体C3与BPI活性区融合蛋白(CB)的构建与表达

补体C3和杀菌通透性增加蛋白(BPI)对血液中的病原体均有黏附、促吞噬甚至杀灭作用,但两者的作用机制不同,制备两者活性区融合蛋白,可能具有更好的清除血液病原的作用。通过重叠延伸PCR融合人补体C3的补体受体Ⅰ、Ⅲ两个结合区,同时调取了杀菌通透性增加蛋白(BPI)活性区段rBPI,先后将补体C3活性区与BPI蛋白功能区基因克隆入原核表达载体pET28a中,获得融合蛋白(CB)表达载体pET28-CB,在大肠杆菌中进行了高表达产量、可溶性表达等条件的摸索,CB融合蛋白主要以包涵体形式表达,Western印迹证明CB具有C3的抗原活性,将包涵体蛋白变性与复性后,利用Ni2+固相化的螯合SepharoseFastFlow亲和层析柱进行浓缩和纯化,最后得到了纯度较高的CB原核表达蛋白,纯化的CB具备C3抗原性。CB融合蛋白的构建和高效表达、纯化,为下步探讨其在促进血液病原清除上的功能鉴定和应用奠定了基础。

鸡、猪BPI氨基端的基因克隆和鉴定

为了克隆杀菌/通透性增加蛋白(BP I)N端cDNA,构建重组体pM D 18-T-BP I,并进行序列鉴定,应用RT-PCR技术,参照G enB ank报道的预测序列,从鸡多形核白细胞(PM N)mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白(BP I)氨基端95个氨基酸的基因片段,并与pM D 18-T连接,构建BP I氨基端的基因重组体,进行酶切鉴定和序列测定;从猪PM N的总mRNA中扩增出BP I氨基端48个氨基酸的基因片段,进行测序鉴定。获得鸡BP I N端长度为285 bp的基因片段。序列分析证实该片段中有3个点突变,但均不在活性中心;获得猪BP IN端长度为146 bp的基因片段。成功克隆出BP I N端基因,经序列测定,确认为BP I基因,为进一步表达该基因奠定了基础。

定点突变对BPI_(23)-Fcγ1重组抗菌蛋白表达和复性率的影响

为提高BPI2 3 Fcγ1重组抗菌蛋白在原核表达系统中的表达和复性率 ,采用定点突变法改造 pBV BPI60 0 Fcγ1 70 0 重组表达载体 ,转化E .coliDH5α后 ,通过温控诱导表达。结果表明 :①突变后BPI2 3 Fcγ1重组抗菌蛋白表达量比突变前提高约 1 0 % ;②表达时间提前约 1h ;③抗菌活性未受影响 ;

鸡BPI氨基端的基因克隆和鉴定

应用RT-PCR技术,参照GenBank报道的预测序列,从鸡多形核白细胞(PMN)mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白(BPI)氨基端95个氨基酸的基因片段,并与pMD18-T连接,构建BPI氨基端的基因重组体,进行酶切鉴定和序列测定。结果表明,获得了BPI N端长度为284 bp的基因片段,序列分析证实该片段中有3个点突变,但均不在活性中心。

BPIN端优势抗原表位的模拟合成及其抗血清的制备

目的通过生物信息学模拟合成杀菌/渗透增强蛋白氨基端(BPIN端)优势抗原表位肽,免疫动物获得相应抗血清。方法利用生物信息学分析BPIN端(1-199)氨基酸序列的抗原性、亲水性、可塑性、表面可及性和二级结构等理化特性,据此设计合成TA/IK两条多肽,将其与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联后,免疫家兔获得相应抗血清;采用间接ELISA法鉴定多肽的抗原性、测定血清抗体效价,Westernblot鉴定抗血清特异性。结果人工合成BPIN端TA/IK两个B细胞表位肽;ELISA检测证实TA/IK抗原肽能与商品化兔抗人BPI55多克隆抗体结合;所获TA/IK抗血清效价分别为1∶51200和1∶25600;Westernblot证实TA/IK抗血清能与BPI55标准品特异性结合。结论模拟合成的TA/IK抗原肽确为BPIN端优势抗原表位,相应抗血清可用于BPIN端功能性片段的检测鉴定。

小鼠Bpi条件基因打靶载体的构建和鉴定

目的构建小鼠Bpi条件基因打靶载体,为建立Bpi条件基因打靶小鼠模型和深入研究Bpi基因功能奠定基础。方法采用Cre/LoxP系统,选择小鼠Bpi基因第2、3外显子作为条件性敲除的目的片段,并在其两侧插入LoxP位点;运用LA-PCR技术,以129品系小鼠ES细胞基因组DNA为模板分步扩增包括Bpi第2、3外显子(中间同源臂)和上游同源臂在内的3.1 kb基因片段以及下游同源臂4.9 kb基因片段;构建pBSKⅡ-5SLoxP和ploxPFRTNeo-3L重组质粒,将前者酶切产物(3.1 kb)与酶切后的ploxPFRTNeo-3L质粒相连获得Bpi条件基因打靶载体。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的pBSKⅡ-5SLoxP、ploxPFRTNeo-3L重组质粒和Bpi条件基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Bpi条件基因打靶载体。

杀菌/通透性增强蛋白N端cDNA的克隆和表达

目的 克隆杀菌 /通透性增强蛋白 (BPI) N端 c DNA,构建原核和真核表达载体 ,分别在大肠杆菌和 CHO细胞中表达 BPI蛋白 .方法 提取正常人外周血多形核粒细胞 (PMN)总 RNA,经套式 RT- PCR法扩增出 BPI N端 c DNA片段 ,将其克隆入 p GEM- T easy载体中并进行酶切鉴定和序列测定 .然后亚克隆入 p GEX- 4T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 ,进行诱导表达 ,表达产物用 Western blot法鉴定 .同时将该基因片断克隆入 pc DNA3质粒 ,通过脂质体转染 CHO细胞 ,免疫荧光法鉴定 BPI的表达 .结果 获得 BPI N端长度为 72 6 bp的基因片断 .序列分析证实该片断中有 4个点突变 ,但均不在活性中心 .在大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量 5 1× 10 3的GST- BPI融合蛋白 ,Western blot反应中在 5 1× 10 3处有显色区带 .G418筛选出的阳性 CHO细胞在免疫荧光反应中产生荧光反应 .结论 我们成功的在大肠杆菌和 CHO细胞中表达了 BPI2 5蛋白 ,为进一步研究

杀菌/通透性增加蛋白的细胞定位

目的 确定人体内能产生杀菌 /通透性增加蛋白(bactericidal/ permeability- increasing protein,BPI)的细胞群体 ,为研究 BPI在细胞内的定位奠定基础 .方法 分离人外周血获得嗜中性多形核粒细胞 (polymorphonuclear neutrophils,PMN )和单个核细胞 ,PMN,HL - 6 0及单个核细胞分别进行RNA提取 ,逆转录 PCR反应扩增 BPI基因片段和免疫荧光法检测 .结果 逆转录 PCR在 PMN和 HL- 6 0细胞中扩增出BPI基因片段 ,活细胞免疫荧光染色观察到 PMN和 HL- 6 0能够与抗 BPI的单抗所结合而呈阳性 .结论

人类粒细胞杀菌蛋白治疗脓毒症小鼠

目的通过对脓毒症模型的治疗过程，观察人类杀菌蛋白（ＢＰ）的治疗作用，并与抗ＬＰＳ单克隆抗体１Ａ比较。方法脓毒症模型采用ＮＨ１雄性小鼠腹腔注射Ｏ１１１Ｂ４大肠杆菌悬液。给药分三组，ＢＰ０１ｍｇ，１Ａ１０ｍｇ，生理盐水（ＮＳ）０５ｍｌ。结果各组生存率无显著性差异（Ｐ＞００５）。第二次攻击后３小时外周血白细胞计数，ＮＳ组稍高于其他两组，分别为１９６±５７×１０６／ｍｌ、１５５±３８×１０６／ｍｌ和１５２±３０×１０６／ｍｌ，差异未达到显著性界值。血浆ＬＰＳ水平：ＢＰ和ｌＡ组明显低于ＮＳ组（Ｐ＜００５）。血浆细胞因子活性：ＢＰ组对细胞因子的抑制作用较强，分别在不同时间点对ＩＬ－１、ＩＬ－６和ＴＮＦ的数据低于ＮＳ组，有显著性差异（Ｐ＜００５）；ｌＡ只在一个时间对ＩＬ－６有抑制作用（Ｐ＜００５）。结论抗ＬＰＳ单抗和ＢＰ对ＬＰＳ均具有阻断作用，但是，ＢＰ的作用更强。两者均不能明显改善动物的生存率，应作为辅助治疗。

肝硬化患者血清内毒素调节蛋白水平及其临床意义

目的探讨检测伴肠源性内毒素血症的肝硬化患者血中内毒素结合蛋白 (LBP)、杀菌性 /通透性增加蛋白 (BPI)及可溶性sCD14水平的临床意义。方法应用基质显色法和ELISA双抗体夹心法 ,检测 45例肝硬化患者血中内毒素脂多糖 (LPS)、LBP、BPI和sCD14水平 ,并以 15例健康献血员作为对照。结果肝功能为A级、B级和C级的肝硬化患者其血中LPS、LBP、BPI和sCD14水平均明显高于献血员 ;肝硬化死亡患者的LPS、LBP、BPI和sCD14水平显著高于存活者。结论肝硬化患者伴肠源性内毒素血症时 ,血清LBP和sCD14水平升高和BPI相对不足 ,可显著提高机体对LPS的敏感性。

新疆巴什拜羊BPI基因序列的生物信息学分析

以新疆巴什拜羊BPI基因为研究对象,运用生物信息学方法对其编码蛋白的结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、二级结构以及高级结构进行生物信息学分析,并推测与其他物种的生物进化关系。结果表明,BPI蛋白分子量为53.4 ku,理论等电点大于7,呈碱性,N端有信号肽,肽链表现为亲水性,基本属于分泌蛋白。BPI蛋白质的二级结构为α螺旋、β折叠和无规则卷曲,有2个保守结构域BPI1和BPI2。通过进化树分析发现巴什拜羊的BPI基因在绵羊、牛、虎鲸、野猪、人、猕猴、家兔、小鼠、非洲爪蟾中,与绵羊首先聚为一类,后与牛聚为一类,这与动物学分类结果一致,这种同源性在一定程度上代表着物种亲缘关系的远近。

绵羊感染支原体后杀菌通透性增加蛋白(BPI)mRNA表达水平的变化

为了检测巴什拜羊和盘羊杂交羊在感染绵羊肺炎支原体(MO)前后杀菌通透性增加蛋白(BPI)表达水平的变化,对试验羊攻毒MO,在感染前(第0天)及感染后的第2、5、7、14及21天,颈静脉采血分离中性粒细胞,采用Real-time q PCR方法检测BPI的表达水平。结果显示,感染后第5天,2组BPI相对表达量升高。巴什拜羊BPI持续升高,杂交羊在第7天表达水平最高,在14-21天则逐渐降低。在第7天,巴什拜羊高于杂交羊(P<0.05),在第14-21天,巴什拜羊极显著高于杂交羊(P<0.01)。说明绵羊感染MO后初期BPI有明显升高趋势,在后期巴什拜羊和杂交羊的BPI变化有差异,这对研究支原体肺炎发病机理提供参考。