乳腺癌易感蛋白BRCA1的BRCT1结构域染色质伸展活性的定位

乳腺癌易感基因BRCA1(Breastcancersusceptibilitygene 1)在乳腺癌的发生、发展中起重要作用。BRCA1C末端含有 2个BRCT结构域 (BRCT1和BRCT2 ) ,许多乳腺癌易感突变发生在BRCA1的BRCT结构域中。利用染色质结构检测技术表明 ,BRCT结构域具有染色质伸展活性。本文利用缺失突变技术构建了 6种BRCT1结构域 (16 42 1736aa)缺失突变体并将BRCT1结构域中与染色质伸展相关的重要区域定位到 16 91 172 1之间的氨基酸残基 ;用丙氨酸扫描技术构建了 10种BRCT1结构域丙氨酸扫描突变体并将重要氨基酸残基序列定位到 170 7 1711之间的IAGGK。利用定位的重要区域进行Blast分析 ,结果找到一新型同源蛋白质。BRCT1结构域的定位有助于预测BRCT1结构域突变后发生乳腺癌的风险 。

乳腺癌易感基因BRCA1的BRCT结构域的融合表达及纯化

乳腺癌易感基因BRCA1在乳腺癌发生、发展中起着重要作用。在其C 末段有两个串联重复的BRCT(BRCT1和BRCT2 )结构域。它们与BRCA1的重要功能密切相关 ,BRCT结构域还存在于其它 5 0多种蛋白中。本文用PCR方法扩增了BRCT1和BRCT2结构域编码序列 ,并将其以正确相位与pGEX 2T载体中的GST编码序列融合 ,构建成重组质粒pGST BRCT1和pGST BRCT2。将这两种重组质粒分别转化E coliDH5α后 ,分别表达了GST BRCT1和GST BRCT2两种融合蛋白。Westernblot检测结果表明 ,两种融合蛋白均能与GST抗体反应。表达的GST BRCT1和GST BRCT2经GST Sepharose 4B亲和层析获得了纯化的融合蛋白 。

乳腺癌易感蛋白BRCA1的BRCT2结构域染色质伸展活性的定位

40 %～ 5 0 %的遗传性乳腺癌和至少 80 %的既有乳腺癌又有卵巢癌家族史的患者是由BRCA1突变引起的 .BRCA1C末端含有 2个BRCT结构域 (BRCT1和BRCT2 ) ,它们与BRCA1的重要功能密切相关 .许多乳腺癌易感突变发生在BRCA1的BRCT结构域中 .利用染色质结构检测技术表明 ,BRCT结构域具有染色质伸展活性 .利用缺失突变技术构建了 6种BRCT2结构域 (175 6～ 185 2位氨基酸残基 )缺失突变体并将BRCT2结构域中与染色质伸展相关的重要区域定位到 175 6～ 180 8之间的氨基酸残基 ;用丙氨酸扫描技术构建了 6种BRCT2结构域丙氨酸扫描突变体并将重要氨基酸残基序列定位到 1784～ 1788之间的VQLCG .BRCT2结构域的定位有助于预测BRCT2结构域突变后发生乳腺癌的风险 ,也为进一步研究BRCT2结构域的功能机制提供了有用的材料 .

含磷酸结合口袋的BRCT结构域功能位点预测

BRCT(BRCA1C-terminus)是真核生物DNA损伤修复系统重要的信号传导和蛋白靶向结构域。为了探讨含磷酸结合口袋的BRCT与磷酸化配体结合的机制,对XRCC1BRCT1、PTIP BRCT4、ECT2BRCT1和TopBP1BRCT1进行了结构保守性和表面静电势分析。结果显示,4个BRCT的磷酸结合口袋周围所存在的结构保守并带正电势的沟槽很可能是其功能位点,并且类似的沟槽在含磷酸结合口袋的BRCT中普遍存在。沟槽两侧及底部均带有极性氨基酸残基,两侧带正电荷,而底部疏水。这说明沟槽与配体的结合以静电和疏水相互作用为主。沟槽主要位于单个BRCT中,而且4个BRCT的沟槽在形状和电荷分布上都不同,说确明BRCT配体特异性主要由单个BRCT决定。磷酸结合口袋位于沟槽中心,说明沟槽可能同时结合磷酸化残基的N端和C端附近残基。

BRCA1相互作用蛋白的分离及鉴定

乳腺癌易感基因 (breastcancersusceptibilitygene 1,BRCA1)在DNA损伤修复、细胞周期调控、染色质的稳定、基因转录激活以及细胞凋亡等方面起着重要作用。BRCA1C 末端是富含酸性氨基酸的转录激活结构域 (AD) ,AD核心结构为两个串联的BRCT结构域 (BRCT1和BRCT2 )。应用酵母双杂交技术 ,以BRCT2为诱饵蛋白 ,从卵巢文库中筛选到了与BRCT2结构域相互作用蛋白FHL2 (fourandhalfLIMdomains)。利用酵母交配的方法证明FHL2与BRCA1BRCT2特异结合 ,而不与BRCA1BRCT1、Rap1BRCT结构域结合。GST沉淀实验表明 ,FHL2在体外特异地与BRCT2结构域相结合 ;免疫共沉淀实验表明 ,FHL2在体内特异地与BRCT2结构域结合 ;FHL2可与全长BRCA1结合。BRCA1与FHL2相互作用的发现为研究BRCA1以及FHL2在肿瘤发生、发展中的作用打下了坚实的基础。

DNA修复基因XRCC1多态性与肺癌易感性研究进展

X线修复交叉互补基因1(XRCC1)是一种重要的DNA修复基因,参与DNA单链断裂和碱基损伤修复,其编码的蛋白质在碱基修复过程中是不可缺少的。该基因的多态性会导致相应的氨基酸改变,从而影响DNA修复,可能引起肿瘤的易感性。XRCC1基因多态性与吸烟交互作用对肺癌易感性的关系仍然存在争论,其相关性需进一步深入研究。

真核生物DNA连接酶Ⅲ的功能演化

DNA连接酶Ⅲ被认为只存在于脊椎动物,并在细胞核DNA的修复和线粒体DNA的复制和修复过程中发挥功能.虽然近来有关于无脊椎动物中存在着DNA连接酶Ⅲ的报道,但其功能演化及在无脊椎动物中的分布仍不清楚.为进一步探讨DNA连接酶Ⅲ的功能演化,进行了数据库搜索、线粒体定位信号(MLS)预测和功能位点保守性分析等.研究结果显示:DNA连接酶Ⅲ在变形虫、动物界和领鞭毛虫中广泛存在,但其在真菌界等发生整个蛋白或部分结构域的丢失;很多物种的DNA连接酶Ⅲ不含线粒体定位信号,因此,它们不太可能在线粒体中发挥作用,而参与细胞核DNA的修复是DNA连接酶Ⅲ较为古老和保守的功能.

siRNA介导的NFBD1表达沉默对HeLa细胞增殖与凋亡的影响

NFBD1,也称MDC1,是1个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子.为探讨NFBD1在细胞增殖和凋亡中的作用及其作为分子靶点用于肿瘤治疗的潜在价值,本研究采用siRNA技术抑制NFBD1的表达,并观察了其对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和细胞凋亡的影响.半定量RT-PCR和蛋白质印迹分析结果表明,筛选到的短链NFBD1 siRNA能有效抑制内源NFBD1的表达,抑制程度约100%.细胞生长曲线分析结果表明,siRNA介导的NFBD1表达沉默导致HeLa细胞生长增殖的显著抑制.FACS分析结果表明,NFBD1表达抑制导致sub-G1峰的出现,同时蛋白质印迹分析观察到了caspase 3和PARP(poly-ADP-ribose polymerase)的剪接激活,表明NFBD1表达抑制诱发了细胞凋亡.在该凋亡过程中,P53及其下游靶分子Bax和Puma的表达水平均没有发生明显变化,但Noxa的表达在mRNA和蛋白质水平上均显著上调,强烈提示该凋亡过程很可能是1个不依赖P53的凋亡途径,且Noxa的转录激活在该凋亡过程中可能起着重要作用.这些结果表明,NFBD1参与细胞生长增殖和凋亡的调节,是一个潜在的肿瘤治疗新靶点.

NFBD1在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

目的:研究NFBD1在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化检测40例NPC组织及20例慢性鼻咽炎组织中NFBD1蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测34例NPC组织和23例慢性鼻咽炎组织中NFBD1 mRNA的表达并分析其与患者性别、年龄、颈淋巴结转移和临床分期的相关性。结果:NPC组织中NFBD1在蛋白水平(χ2=9.600,P=0.002)和mRNA水平(t=3.206,P=0.002)表达均高于慢性鼻咽炎组织,NFBD1在mRNA水平的表达高低与患者的性别(t=0.937,P=0.356)、年龄(t=0.382,P=0.698)及是否伴有临床颈淋巴结转移(t=1.037,P=0.322)、临床分期(t=0.293,P=0.771)均没有相关性。结论:NFBD1可能参与了NPC的发生,但其与NPC的侵袭转移没有明显联系。

人NFBD1启动子区域顺式作用元件CHR的定点突变分析

目的对NFBD1启动子区域顺式作用元件CHR进行定点突变分析,以分析CHR在NFBD1转录调控中的作用。方法以原有NFBD1核心启动子荧光素酶报告基因重组体NFBD1-PS1-325为模板,采用PCR介导的基因定点突变技术对NFBD1启动子区域中的CHR位点进行定点突变,构建相应的CHR定点突变重组体;采用荧光素酶双报告基因分析技术检测各重组体的启动子活性,分析CHR定点突变对NFBD1启动子活性的影响;结合阿霉素处理,分析CHR在DNA损伤后NFBD1转录下调中的潜在作用。结果CHR定点突变后能显著降低NFBD1的启动子活性;CHR定点突变后显著减弱了DNA损伤后NFBD1的转录下调比例。结论CHR参与NFBD1的基础转录调控及DNA损伤后的转录下调。

Pax转录激活结构域相关蛋白PTIP的研究进展

PTIP蛋白(PAX Transcription activation domain Interacting Protein,PAXIP1)含有6个BRCT结构域和位于蛋白中间的polyQ区域。研究表明PTIP通过控制组蛋白甲基化来调节基因转录且在DNA损伤修复和维持基因组的稳定性中发挥着重要作用。本文对近年来关于PTIP的重要结构域以及其在生物体发育中的重要功能研究进展作一综述。

抑制NFBD1的表达对鼻咽癌化疗敏感性的影响

目的:研究抑制NFBD1表达后,对鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞化疗敏感性的影响。方法:将NFBD1 siRNA导入NPC细胞系,采用RT-PCR和蛋白质印记法检测siRNA对NPC细胞NFBD1表达的抑制效果;NFBD1 siRNA转染后,MTT法分析NPC细胞对化疗药物敏感性的影响。结果:NFBD1 siRNA转染NPC细胞后,能高效、特异地在mRNA水平及蛋白质水平抑制NFBD1的表达;MTT结果分析表明,NFBD1 siRNA转染后,能显著提高NPC细胞系对化疗药物的敏感性。结论:NFBD1 siRNA转染后抑制NPC NFBD1表达,可显著提高其对化疗药物顺铂的敏感性。

沉默NFBD1表达对鼻咽癌细胞凋亡的影响

目的:研究抑制NFBD1表达后,对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞株HNE-1凋亡的影响。方法:用NFBD1shRNA慢病毒感染HNE-1,采用real-time PCR和Western blot检测NFBD1 shRNA慢病毒对NFBD1的抑制效果;Hoechst33342染色观察细胞核的改变并结合流式细胞仪(flow cytometry,FCM),TUNEL法检测细胞的凋亡情况。结果:NFBD1 shRNA慢病毒在mRNA和蛋白质水平均能高效、特异性地抑制NFBD1的表达;Hoechst33342染色结果显示,在NFBD1下调组,呈现固缩且边缘化的细胞核数量明显增加(χ2=5.367;P=0.021);TUNEL染色结果显示,在NFBD1下调组,显现荧光的凋亡细胞明显增加,FCM检测结果显示,在NFBD1下调组,细胞凋亡率明显增加(χ2=326.86;P<0.001)。结论:抑制NFBD1基因的表达后,能有效促进HNE-1凋亡,这为寻求NPC的治疗靶点提供新的思路。

DNA修复基因XRCC1研究进展

X线修复交叉互补基因 1(XRCC 1)是一种重要的DNA修复基因 ,参与DNA单链断裂和碱基损伤修复 ,位于人染色体 19q13 2 ,编码区单核苷酸多态位点导致相应的氨基酸改变。对其生物学特性、结构功能、基因多态与疾病易感性等方面的研究 ,可深入理解XRCC 1基因多态与环境交互作用对个体易感性的重要影响 ,其可能是某些疾病如癌症发生中潜在的易感标志物 ,对特定亚人群的筛检、预防和指导临床用药有深远意义。

转化生长因子β1基因启动子区C-509T多态性与儿童哮喘易感性及气道重塑关系研究

目的探讨转化生长因子β1（TGF-p1）基因启动子区C-509T多态性对儿童哮喘易感性及对气道重塑的影响。方法收集2008年3月至2010年10月新乡医学院第一附属医院呼吸内科和儿科住院及门诊哮喘患儿110例为哮喘组，其中男61例、女49例；选择同期住院非呼吸系统疾病患儿144例为对照组。采用以医院为基础的病例对照研究方法，C-509T多态性用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）技术进行基因分型；运用高分辨率CT（HRCT）扫描并测量能显示支气管横截面的气道壁内外径、内外腔面积，通过公式计算出气道壁厚度与外径比（T／D）、气道壁面积占气道总横截面积百分比（WA％）。结果哮喘组C-509T位点T等位基因频率显著高于对照组（P=0．006，OR=1．66，95％CI：1．16-2．37）。相比较TT和TC基因型，CC基因型携带者哮喘患病危险性明显降低（P=0．004，OR=0．46，95％CI：0．27-0．79）。轻中度喘组wA％为（67．41±10．72）％、重度哮喘纽为（73．65±9．94）％，与对照组（63．26±8．12）％比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；重度哮喘组T／D值显著高于轻中度组。携带cT和TT基因型患儿的T／D、WA％显著高于cC基因型（P〈0．05）。结论TGF-Bl基因启动子区C-509T位点多态性与儿童哮喘发病相关，同时该位点多态性亦可能是哮喘气道重塑的影响因素之一。