基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略

Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白,其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治,产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点,特别是随着Bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰,为其功能修饰和创新应用创造了条件,相关研究蓬勃发展,成效显著。大量研究表明,采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略,是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体Bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段;此外,采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略,也是助推Bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了Bt毒素结构功能和作用机制,梳理了基于Bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于Bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展,并结合作者团队在模拟Bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果,探讨了基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径,为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。

Animal Safety Test of Bacillus thuringiensis BT Protein

[Objectives]To determine the biological safety of BT protein from Bacillus thuringiensis(Bt)fermentation broth to mammals at high doses.[Methods]Healthy mice were randomly divided into 4 groups with 10 mice in each group.The experimental groups were fed with Bt fermentation supernatant at 0.2,0.6 and 1.0 mL/kg,respectively,once a day for 7 consecutive days.The blank control group was fed normally without intragastric administration.[Results]There was no significant difference in blood routine and blood biochemical analysis between the experimental group and the control group.After intragastric administration,the mice were dissected,and no obvious pathological changes were found;the heart,liver,spleen,lung and kidney were taken to make tissue sections,and no pathological changes were found by microscopic observation.[Conclusions]Mice can tolerate high doses of BT protein from B.thuringiensis fermentation broth.

低温胁迫对Bt棉纤维中杀虫蛋白含量及氮代谢的影响

本研究以常规种泗抗1号(Sikang 1,SK1)和杂交种泗抗3号(Sikang 3,SK3)为材料进行盆栽试验,研究了不同低温水平及其处理持续时间对Bt棉盛铃期纤维中杀虫蛋白含量变化及氮代谢生理特征。结果表明,纤维中的杀虫蛋白含量随着温度的降低总体呈下降趋势,同时低温处理持续期显著影响杀虫蛋白含量。与对照相比,纤维中杀虫蛋白含量的降低幅度随低温胁迫时间的延长而增大。此外,随着处理温度的降低,可溶性蛋白含量、谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性呈下降趋势,游离氨基酸含量、肽酶活性、蛋白酶活性呈上升趋势,且在低温处理48 h后,均与杀虫蛋白含量呈极显著相关。因此,低温胁迫促使了蛋白质的合成功能下降,分解能力增强,导致可溶性蛋白含量下降,游离氨基酸含量升高,最终导致杀虫蛋白含量下降,且其受低温胁迫持续期显著影响。

昆虫对杀虫剂和转Bt基因植物的抗性进化机制研究进展

为防治昆虫对农作物的危害,采取了喷施杀虫剂和种植转Bt基因抗虫植物等措施。然而,杀虫剂的大规模使用和转Bt基因抗虫植物的大面积连续种植使得一些靶标昆虫产生了抗性进化,这不仅影响防治效果,而且还影响整个农业生态系统服务功能。本文综述了昆虫对化学杀虫剂、微生物杀虫剂和转Bt基因植物产生抗性的分子机制。昆虫对化学杀虫剂的抗性进化机制主要是靶标位点敏感性下降和解毒酶系活性增强;对微生物杀虫剂的抗性进化机制主要是免疫系统激活和共生菌群变化;对转Bt基因植物的抗性进化机制主要是昆虫中肠结合受体基因突变或表达下调和中肠蛋白酶活性降低。为了减缓昆虫抗性进化和提高杀虫剂效率,未来建议减少使用化学杀虫剂,合理利用杀虫谱广和活性高的微生物杀虫剂以及抗虫植物等方法系统治理农业害虫。

深入了解目的基因(Bt基因)的检测与鉴定

目的基因的检测与鉴定是基因工程基本操作程序的最后一步,用以确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定表达其遗传特性。本文结合实际教学案例,介绍目的基因的检测和鉴定方法,为理解基因工程提供一定的参考。

BTO环境下基于供应链协调的厂商生产方式匹配选择模型

首先指出BTO环境给供应链的协调运营带来新的挑战,而供应链厂商的生产方式决策是亟待解决的问题之一。随后,在给出供应链厂商生产方式匹配选择矩阵之后,通过基于假设条件和供应链成本结构分析的一次和二次剔除,对初始选择矩阵给出的九种厂商生产方式匹配模式作出甄别,并最终对两种可行的供应链厂商生产方式匹配模式予以确认。

常见水稻病虫害胁迫对转cry1C基因抗虫水稻Bt蛋白表达量的影响

【目的】明确转Bt基因抗虫水稻在病虫害胁迫下对Bt蛋白表达量的影响。【方法】以Bt水稻T1C-19(表达Cry1C蛋白)为研究对象,探究褐飞虱、白叶枯病等6种水稻常见病虫害胁迫下其体内Bt蛋白的表达量变化。【结果】褐飞虱取食引起T1C-19水稻叶片中Bt蛋白含量降低,而黑尾叶蝉取食显著降低了T1C-19水稻叶鞘中的Bt蛋白含量,白叶枯病侵染导致Bt水稻叶鞘中的Bt蛋白含量显著上升。二化螟、水稻普通矮缩病、稻瘟病的胁迫对转基因水稻T1C-19叶片和叶鞘中的Bt蛋白含量均无显著影响。【结论】病虫害胁迫因种类不同对Bt水稻中Bt蛋白表达量的影响有所不同。这将为Bt水稻的抗虫效果评价提供数据基础,同时为Bt水稻病虫害综合治理提供科学依据。

棉铃虫围食膜中Bt抗性相关蛋白的分离与鉴定

棉铃虫是世界性的重要农业害虫。围食膜作为昆虫抵御病原微生物入侵及有害物质的第一道天然保护性屏障,其上可能存在与Bt抗性相关的受体蛋白。本研究以Bt Cry1Ac抗性和敏感品系的棉铃虫围食膜为对象,采用NuPAGE电泳技术、配体杂交、质谱鉴定和生物信息学分析等技术,测定了围食膜蛋白含量,鉴定了蛋白质的组成及与Bt Cry1Ac毒素的结合能力。结果表明敏感品系围食膜中蛋白含量为22.19%,抗性品系围食膜中蛋白含量为26.99%。抗、感品系棉铃虫围食膜上存在与Cry1Ac毒素结合的6个差异蛋白,推测其中棉铃虫羧酸酯酶蛋白和血影蛋白是2个有意义的抗性相关蛋白,2个新蛋白可能参与Bt抗性。研究证明棉铃虫围食膜上存在Bt结合蛋白且与抗性相关,为进一步明确Bt抗性机制、制定合理的Bt抗性治理策略提供了理论依据。

实验条件下BT肽对南美白对虾副溶血性弧菌的攻毒试验

副溶血弧菌引起的急性肝胰腺坏死病是南美白对虾的主要病害之一。通过在饲料中添加BT肽并进行攻毒实验来探究BT肽是否能够增强南美白对虾的天然免疫力。结果表明,在饲料中添加BT肽可以显著提高南美白对虾对副溶血弧菌的抗病能力,但是免疫保护的持续时间稍显不足,其原因有待进一步研究。

高温干旱下缩节胺通过调节碳和氨基酸代谢提高Bt棉杀虫蛋白含量的生理机制

【目的】探讨高温干旱胁迫下缩节胺(mepiquat chloride,DPC)调控Bt(Bacillus thuringiensis)棉杀虫蛋白含量的生理机制,为高抗虫性Bt棉品种选育及高产高效栽培提供理论依据。【方法】2020—2021年以转Bt抗虫基因抗虫棉品种泗抗3号为材料,采用盆栽法,在人工气候室进行高温干旱胁迫,胁迫开始后立即用20 mg·L^(-1) DPC和清水(对照)喷施。7 d后测定铃壳杀虫蛋白含量、α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量以及谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸转氨酶活性、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量。并进行转录组测序,利用DESeq进行差异基因分析,通过GO富集和KEGG Pathway数据库注释参与DPC调节杀虫蛋白含量的差异表达基因。【结果】与清水对照相比,DPC可显著提高高温干旱条件下Bt棉铃壳中杀虫蛋白含量,提高幅度达4.7%—11.9%。在碳代谢方面,α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量提高46%—57%和25%—29%;在氨基酸代谢方面,谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸转氨酶活性、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量分别提高32%—44%、30%—40%、28%和22%—27%。转录组分析结果表明,DPC处理后上调基因7542条,下调基因10449条。GO和KEGG结果显示,差异基因主要涉及氨基酸代谢、碳代谢等生物过程。其中编码6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶、谷氨酸丙酮酸转氨酶、丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶、谷氨酸合酶、吡咯啉-5-羧酸脱氢酶、谷氨酸草酰乙酸转氨酶、N-乙酰谷氨酸合成酶、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶基因表达显著上调。【结论】高温干旱下,DPC通过调节碳、氨基酸代谢增加丙氨酸、α-酮戊二酸含量,提高天冬氨酸、谷氨酸、丙酮酸和精氨酸合成能力,进而提高Bt棉杀虫蛋白含量。

Cry类和Vip3Aa类Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力和增效作用

筛选对靶标害虫高效的Bt杀虫蛋白、评价蛋白组合对靶标害虫的杀虫作用,对于转基因抗虫新品种的研发具有重要的指导意义。本文采用人工饲料混合法评价了Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19共8种Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力;同时评估了Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合蛋白对亚洲玉米螟的杀虫作用,筛选出毒力最佳的组合比例。结果表明:Cry1Ab、Cry1Fa、Cry2Aa对亚洲玉米螟的LC 50在0.24~0.72μg/g之间,其中Cry1Ab的毒力最强,显著高于Cry1Fa和Cry2Aa蛋白,Cry1Fa与Cry2Aa毒力无显著性差异。Cry1Ca、Cry1Ba、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19对亚洲玉米螟的LC 50均大于50μg/g。当Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例为1∶1时,增效作用最强,增效因子分别为3.18和1.58。本研究结果为多价转基因玉米的研发提供了重要依据。

转Bt基因玉米的生态安全性研究进展

随着转基因作物的应用和推广 ,转 Bt基因作物释放后对生态环境及其它方面产生的潜在影响越来越受到重视。分别从生物活性杀虫晶体蛋白在土壤中的残留特性、杀虫晶体蛋白对土壤中非目标生物的影响、转 Bt基因玉米植株体成分的变化、转Bt基因玉米花粉中杀虫晶体蛋白的表达特性及其在田间和马力筋叶片上的散积状况、花粉中表达的杀虫晶体蛋白对君主斑蝶的毒性、君主斑蝶幼虫暴露在 Bt花粉中的概率及综合风险评价估算等方面对转 Bt基因玉米产生的杀虫晶体蛋白与土壤生态环境的相互作用、花粉对非目标生物影响的研究现状进行了综述。通过对转 Bt基因作物生态安全性的科学评价和广泛宣传 ,以确保生物技术的健康发展。

转Bt基因植物表达产物Cry1Ab蛋白的制备纯化方法研究

以转Bt基因水稻为试材,研究其表达产物Cry1Ab蛋白的提取、分离及纯化的方法。实验结果表明,DEAE纤维素填料对Bt蛋白有较好捕获效果。根据生物信息学方法预测了目标蛋白和主要共存蛋白的等电点和疏水性差异。合理地选择了阴离子交换色谱与疏水作用色谱组合方法。提取液经DEAESephadexA50柱层析及PhenylSepharoseFastFlow疏水层析分离后,目标蛋白得到了显著的纯化。考察了疏水层析中用不同洗脱液洗脱Cry1Ab蛋白对活性回收率和纯度的影响,结果表明:以0.25mol/LKSCN作洗脱液对活性影响最小,HIC一步纯化倍数可达8倍,总纯化倍数达100倍。

高性能BT树脂基覆铜板的研制

研制出了双烯封端棒状聚酰亚胺,并用其改性BT树脂,制得了低收缩BT树脂/石英布覆铜板。其平面方向热膨胀系数为3.1106℃1,厚度方向为1.3105℃1,优于国外同类产品;另用聚苯醚改性BT,制得低介电常数的BT树脂/玻璃布覆铜板,其er可小到3.6(106 Hz),厚度方向热膨胀系数为4.07×105℃1。改性后保留了BT树脂的其它优良特性。

美国白蛾中肠受体蛋白HcABCC4与BtCry9Ea10结合特性分析

为明确苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis Cry9Ea10毒素蛋白对美国白蛾(Hyphantria cunea)的作用,本研究测定了其对美国白蛾四龄幼虫的活性,采用邻接法构建了美国白蛾中肠受体蛋白HcABCC4系统发育树;Ligand blot和ELISA试验研究了Bt Cry9Ea10毒蛋白与HcABCC4受体蛋白间的结合能力;利用HcABCC4基因dsRNA,采用注射法比较了基因沉默前后Cry9Ea10毒素对美国白蛾的毒力变化。结果表明,Bt Cry9Ea10蛋白对美国白蛾幼虫有杀虫活性,毒力回归方程为y=-4.61+2.28x,LC_(50)和LC_(70)值分别为115.60和177.58μg/mL。美国白蛾HcABCC4氨基酸序列(GenBank登录号:MW727508.1)与夜蛾科棉铃虫Helicoverpa armigera(XM 049842273.1)、美洲棉铃虫H.zea(XM 047179823.1)、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(XM 035574947.2)、斜纹夜蛾S.litura(KP335688.1)的ABCC4氨基酸序列聚为一支、相似性一致;Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac毒素与HcABCC4 TMD结构域重组蛋白能特异结合,解离常数Kd值分别为(276.80±0.056)、(131.30±0.087)nmol/L,最大亲和力Bmax值分别为(0.23±0.06)、(0.86±0.086)。与对照组相比,美国白蛾注射HcABCC4 dsRNA后基因表达量下降58.04%,Cry9Ea10蛋白平均校正死亡率下降58.97%(P<0.05)。据此推断美国白蛾中肠HcABCC4蛋白是Bt Cry9Ea10的特异受体,为进一步揭示Bt Cry9Ea10蛋白的杀虫机制提供了资料。

喷施尿素对Bt棉蕾的杀虫蛋白含量影响及氮代谢机制

以常规种泗抗1号(SK-1)和杂交种泗抗3号(SK-3)作为试验材料,设置喷清水(CK)和不同浓度(1.0%~10.0%)尿素处理,研究喷施不同浓度尿素对Bt棉蕾中杀虫蛋白表达量的影响。结果表明:随着尿素浓度的增加,棉蕾中杀虫蛋白含量呈先增加后降低的趋势,尿素浓度7.0%~8.0%处理的棉蕾中杀虫蛋白含量最高,较对照增加14.9%~24.8%。氮代谢机制表明,棉蕾中可溶性蛋白质和游离氨基酸含量增加,谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)、谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活性提高,与Bt杀虫蛋白含量表现一致;蛋白酶和肽酶活性与Bt蛋白含量量呈相反特征。主成分分析进一步表明,两品种棉蕾的可溶性蛋白质和游离氨基酸含量,GS、GOGAT、GOT和GPT活性对Bt杀虫蛋白含量变化的贡献分别达71.8%和72.4%;蛋白酶和肽酶活性对Bt杀虫蛋白含量变化的贡献分别为23.4%和21.6%。综上,蕾期根外喷施尿素,Bt棉蕾的蛋白质合成提高是杀虫蛋白含量提高的主要原因。

土壤增氮对棉花当日花Bt杀虫蛋白含量影响及相关生理机制

以Bt棉常规品种泗抗1号、杂交品种泗抗3号为材料,在常规施氮量(CK,300 kg·hm^(-2))水平上,设计增施氮素25%、50%、75%、100%4个处理,探讨土壤增氮对棉花当日花中Bt杀虫蛋白含量的影响及其蛋白质代谢机制。结果表明:两类型品种当日花中Bt杀虫蛋白含量均随施氮量增加呈先升高后降低的趋势,且在施氮量增加75%时当日花中Bt蛋白含量达最大值,较CK增加37.8%~85.2%。氮代谢生理机制表明,施氮量增加75%时当日花可溶性蛋白质含量、游离氨基酸含量、蛋白质合成关键酶[谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、谷氨酸合成酶(glutamate synthase,GOGAT)]活性显著提高;蛋白质分解关键酶(蛋白酶、肽酶)活性则随施氮量增加呈下降趋势,但处理间差异不显著。在常规施氮水平上适量增氮有利于促进Bt杀虫蛋白合成,从而提高棉花Bt抗虫性。

重金属和Bt蛋白联合暴露对细菌毒性的影响

为考察重金属和Bt蛋白联合暴露对微生物生物毒性的影响,本研究选用Zn^(2+)、Cd^(2+)作为重金属离子代表,Cry1Ac蛋白作为Bt蛋白代表,通过分析不同条件下大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的生长曲线、菌落数、活性氧(ROS)产生量,探究Zn^(2+)、Cd^(2+)、Cry1Ac蛋白单独和联合暴露对细菌生长及毒性的影响,同时选用费氏弧菌(Vibrio fischeri)进行急性毒性试验。结果表明:Zn^(2+)、Cd^(2+)及Cry1Ac蛋白浓度增加(Zn^(2+)为2~20μg∙mL^(-1),Cd^(2+)为2~10μg∙mL^(-1),Cry1Ac为0.2~4μg∙mL^(-1))对E.coli、B.subtilis生长产生抑制作用,细菌存活率也显著降低(P<0.05),其中B.subtilis的耐性强于E.coli;细菌ROS产生量表明,单独Zn^(2+)、Cd^(2+)能对细菌造成严重氧化损伤,而Zn^(2+)、Cd^(2+)与Cry1Ac蛋白结合能显著降低(P<0.05)金属对E.coli和B.subtilis的氧化损伤,结合后Zn^(2+)-Cry1Ac对大肠杆菌毒性效果强于Cd^(2+)-Cry1Ac;发光细菌试验结果进一步表明Cry1Ac蛋白能缓解Zn^(2+)、Cd^(2+)对细菌的毒害。研究表明重金属和Bt蛋白联合暴露时Bt蛋白能缓解重金属对细菌的毒性。

商用BT细胞中污染病毒的检测及基因序列分析

为了解商用BT细胞系中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛细小病毒(BPV)、呼肠孤病毒3型(Reo3)、牛腺病毒(BAdV-3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)6种病毒的污染情况,对购买的商用BT细胞进行病原PCR检测、细胞病变观察、上清液PCR检测,以及阳性病原部分基因序列的测序和分析。结果显示:对细胞培养液进行6种病毒的PCR扩增,仅BVDV出现特异性目的条带,其他病原均为阴性;目的条带测序后经BLAST分析,确定为BVDV阳性;7 d内BT细胞未出现细胞病变,细胞上清液可扩增出BVDV目的条带,并随着培养时间的增加条带亮度逐渐增强;通过基于BVDV 5'UTR、Npro和E2基因序列的遗传进化分析发现,该毒株与Oregon C24V毒株亲缘关系较近,为BVDV-1a型。结果表明,商用BT细胞存在BVDV-1a污染,因此应加强其相关生物制品的BVDV检测,防止BVDV污染扩散。