神经节苷脂类抑制BT325细胞系的生长

应用自提的神经节苷脂GM 3,牛脑神经节苷脂 (bovinebraingangliosides,BBG)加入低血清培养的人多形成胶质细胞瘤BT32 5细胞中观察其对该细胞系的影响 ;以及GM3、BBG对表皮生长因子(EGF)刺激该细胞系生长的拮抗作用 .结果表明GM3、BBG均能抑制BT32 5细胞生长 ,GM 3的抑制作用远高于BBG ,其抑制率为 60 2 8% (P <0 0 1 ) ,BBG为 1 9 33% ,在含不同浓度的EGF培养液中分别加入GM3、BBG均可拮抗EGF对BT32 5生长的刺激作用 ,GM3的拮抗作用远高于BBG .

神经节苷脂类抑制BT325细胞系生长机理的初步探讨

用１２５ＩＥＧＦ与人多形成胶质细胞瘤ＢＴ３２５细胞系膜上ＥＧＦ受体的饱和结合实验，竞争抑制实验研究ＧＭ３，ＢＢＧ（ｂｏｖｉｎｅｂｒａｉｎｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）对ＥＧＦ受体最大结合量，亲和常数及受体数目的影响；放射受体法观察ＥＧＦＥＧＦＲ复合物内吞过程，测定胞质和培养基中ＥＧＦ含量．结果表明：ＢＴ３２５细胞质膜上存在高亲和力ＥＧＦ结合位点，ＧＭ３对ＥＧＦ与其受体的亲和力无明显抑制作用（Ｐ＞００５），但能明显减少其受体的数目（Ｐ＜００５）；ＧＭ３能明显延长ＥＧＦＥＧＦＲ复合物内吞过程；ＧＭ３处理的胞质中ＥＧＦ浓度比对照组显著升高（Ｐ＜００５），培养液中无明显差异。

商用BT细胞中污染病毒的检测及基因序列分析

为了解商用BT细胞系中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛细小病毒(BPV)、呼肠孤病毒3型(Reo3)、牛腺病毒(BAdV-3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)6种病毒的污染情况,对购买的商用BT细胞进行病原PCR检测、细胞病变观察、上清液PCR检测,以及阳性病原部分基因序列的测序和分析。结果显示:对细胞培养液进行6种病毒的PCR扩增,仅BVDV出现特异性目的条带,其他病原均为阴性;目的条带测序后经BLAST分析,确定为BVDV阳性;7 d内BT细胞未出现细胞病变,细胞上清液可扩增出BVDV目的条带,并随着培养时间的增加条带亮度逐渐增强;通过基于BVDV 5'UTR、Npro和E2基因序列的遗传进化分析发现,该毒株与Oregon C24V毒株亲缘关系较近,为BVDV-1a型。结果表明,商用BT细胞存在BVDV-1a污染,因此应加强其相关生物制品的BVDV检测,防止BVDV污染扩散。

干扰ClC-2基因表达对胶质瘤BT-325细胞生长的影响

目的观察抑制容积调控氯通道ClC-2基因的表达对胶质瘤BT-325细胞生长的影响。方法设计和构建两个针对ClC2基因的小干扰RNA(siRNA)重组表达载体,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染,将空载体质粒和两个重组质粒分别转染入BT-325细胞(依次为对照组、PP1组和PP2组);通过RTPCR检测ClC2基因mRNA表达变化;MTT分析检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期。结果与对照组相比较,干扰组ClC2基因的mRNA水平明显降低,细胞生长速度明显减慢,细胞周期进程被阻滞在G1期。结论干扰胶质瘤细胞系BT-325细胞的ClC-2基因表达可以抑制细胞的生长,提示ClC2基因可能成为控制胶质瘤恶性生长的新靶点。

不同胃癌细胞系中B7-H1分子的表达水平及定位

目的通过检测胃癌细胞系SGC7901/VCR、SGC7901和BGC-823,以及永生化胃上皮细胞系GES中B7-H1的表达,探讨B7-H1与胃癌的发生及多药耐药(MDR)的关系。方法上述细胞系培养于含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中,利用RT-PCR技术、细胞免疫化学染色以及细胞免疫荧光染色技术与流式细胞术检测4种细胞系中B7-H1 mRNA与B7-H1蛋白的表达情况,并比较其在4种细胞系中的表达强度。结果B7-H1 mRNA在4种细胞系中均有表达,表达强度按照GES-1、BGC-823、SGC-7901、SGC-7901/VCR的顺序递增;细胞免疫化学染色与免疫荧光染色表明,B7-H1蛋白主要表达在上述细胞的细胞膜和少量细胞浆中,结合流式细胞术检测进一步证实,B7-H1蛋白在4种细胞系中的表达结果与mRNA的表达一致。结论B7-H1表达在胃上皮细胞上,可能通过抑制机体免疫反应,促进胃癌细胞生长及MDR基因表达。

Twist促进乳腺癌细胞BT-549乳腺细胞小球形成及其迁移

目的探讨Twist基因功能缺失对乳腺肿瘤干细胞样细胞富集及其迁移的影响。方法采用shRNA干扰技术构建Twist基因敲减的BT-549乳腺癌细胞株(BT-549-sh Twist细胞株)和阴性对照细胞株BT-549-sh Vec;采用实时荧光定量PCR和Western blot法验证干扰效率;长程无血清悬浮培养方法富集具有干细胞特性的乳腺癌细胞小球(mammosphere);TranswellTM法检测乳腺癌细胞小球的迁移能力。结果采用shRNA干扰技术成功构建Twist基因敲减的BT-549乳腺癌细胞株BT-549-sh Twist细胞株;BT-549-sh Twist细胞株的mammosphere富集能力和迁移能力减弱。结论 Twist促进BT-549乳腺癌乳腺细胞小球形成及其迁移。

丁酸钠对人脑多型性胶质母细胞瘤细胞系BT-325的诱导分化

目的 研究丁酸钠体外诱导人脑多型性胶质母细胞瘤细胞系 BT-325细胞的分化。方法 以 1mmol/L丁酸钠处理 BT-325细胞 ,测定细胞生长曲线 ,流式细胞术分析细胞周期， Western blot分析 BT-325中 GFAP的表达变化 ,鉴定细胞的分化状态。结果 BT-325细胞经丁酸钠诱导 6～ 8 d后，出现明显的分化特征：胞体显著增大，贴壁明显，细胞伸出多个突起，与相邻的细胞接触，且有接触抑制现象；细胞生长显著受抑 ,80％的细胞被阻断在 G1和 S期；胶质纤维酸性蛋白的含量明显增加。结论 经 1mmol/L丁酸钠处理后 ,人脑多型性胶质母细胞瘤细胞系 BT-325细胞发生一定程度的分化。

用碳-铂复型与免疫电镜技术对人脑胶质瘤细胞系BT_(325)整装细胞骨架的研究

人脑胶质瘤细胞系BT_(325)细胞用含Triton X-100的缓冲液处理后,用针对波形纤维蛋白(vimentin)的单克隆抗体,与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗血清进行间接免疫荧光染色。在荧光显微镜下观察后,将细胞用酒精逐级脱水,然后进行临界点干燥。将干燥后的细胞进行碳-铂喷镀,所得到的碳-铂复型用透射电镜观察。用本法可清晰地观察到完整的细胞骨架,以及微管、微丝与中间丝的形态与分布。在经vimentin单克隆抗体免疫染色的细胞内,中间丝直径较粗;在用GFAP抗血清染色后,只有部分细胞内中间丝直径较粗。如将Triten处理的细胞先用甲醛固定后,再进行免疫染色,中间丝直径增加较少;但如果先进行免疫染色后再用甲醛固定,中间丝直径显著增加。这与免疫荧光观察结果相一致,说明甲醛固定对中间丝分子上的抗原位点起破坏或遮蔽作用。

人脑胶质瘤细胞系BT_(325)细胞骨架的免疫荧光研究

本文报告对人脑胶质瘤细胞系BT_(325)细胞骨架的免疫荧光研究,并比较了几种固定剂和缓冲液对不同细胞骨架成分的影响。除微管及微丝均被染色外,所有细胞均为波形纤维蛋白(vimentin)染色阳性,但只有部分细胞为胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性。说明vimentin是BT_(325)细胞内中间丝的主要成分,而GFAP仅在部分细胞内表达。实验结果还表明,甲醇与甲醛-丙酮、甲醛-Triton固定微管效果较好,而甲醇、醋酸酒精适用于中间丝的固定,甲醛固定也适用于微丝染色。如用Triton处理后进行染色,则缓冲液成分对微管与中间丝影响较大,而微丝不大受影响。本文还观察到,如在Triton处理后先用甲醛固定,再进行免疫染色,则vimentin染色很弱。如先进行免疫染色,然后再用甲醛固定,则vimentin染色很强。结果表明,甲醛固定对vimentin-分子上的抗原位点起遮蔽或破坏作用。

p53和bcl-2表达与BT325细胞辐射性凋亡的关系

目的探讨癌基因表达的变化与辐射诱导肿瘤细胞凋亡的关系。方法采用免疫组化技术检测人多形性胶质母细胞瘤细胞系，经Ｘ射线处理前后ｐ５３、ｂｃｌ－２基因表达的变化；原位杂交方法检测ｐ５３基因在ｍＲＮＡ水平表达的变化。结果①凋亡组内ｐ５３蛋白表达率明显高于对照组，ｂｃｌ－２表达显著减弱，ｐ５３与ｂｃｌ－２蛋白表达呈显著性负相关。②凋亡组内ｐ５３在ｍＲＮＡ水平表达量明显高于对照组，ｐ５３基因在蛋白水平与ｍＲＮＡ水平表达呈显著性正相关。

CD、Flt-1基因共表达重组质粒的构建及对BT325细胞增殖的抑制作用

目的构建CD、Flt-1基因共表达重组质粒,并检测其对BT325细胞增殖抑制的影响。方法从大肠杆菌及人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-RCR)扩增CD基因和FLT-1基因片段,应用基因重组技术将CD基因和Flt-1基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,经酶切鉴定及DNA序列分析证实所构建的载体。转染BT325细胞株,通过MTT法和流式细胞术观察其对细胞的增殖抑制作用。结果 RT-RCR方法获得CD基因和Flt-1基因片段,酶切分析和DNA测序鉴定表明重组质粒pEGFPC1-CD-Flt-1构建成功。转染72h后实验组细胞生长速度是control组的(33.2%±5.4%),流式细胞术发现实验组细胞的G1期细胞比例明显高于control组,细胞出现凋亡,实验组细胞的凋亡率为(19.7%±5.45%)。结论成功构建真核表达重组质粒pEGFP-C1-CD-Flt-1,其体外可抑制BT325增殖并诱导其凋亡。

Flt-1基因对BT325细胞VEGF蛋白表达及细胞增殖的影响

目的 探讨Flt-1基因对BT325胶质瘤细胞VEGF蛋白表达及细胞增殖的影响.方法 从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增Flt-1基因片段,基因重组技术将Flt-1基因片段插入真核表达载体pEGFP-C1中,双酶切及DNA测序鉴定pEGFP-C1-Flt-1重组质粒.pEGFP-C1-Flt-1重组质粒转染BT325胶质瘤细胞,转染后72hELISA法检测培养上清液中VEGF含量,MTT法检测细胞的增殖情况.结果 RT-PCR方法证实从人脐静脉血内皮细胞中成功获得1 384 bp Flt-1基因片段;经双酶切分析和DNA测序鉴定表明重组质粒pEGFP-C1-Flt-1构建成功;ELISA检测发现,BT325细胞被转染后72 h VEGF含量转染组为（56.3±41.2） pg/ml,空载体转染组为（95.5±35.3） pg/ml（P＜0.05）;MTT法检测发现,转染组和空载体转染组的生存率分别为（42.6±3.7）％和（92.8±6.6）％（P＜0.05）.结论 Flt-1基因可抑制BT325细胞VEGF的蛋白表达,抑制细胞增殖.

十二碳烯酸对人乳腺癌细胞株BT-20环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷水平的影响

目的观察十二碳烯酸对人乳腺癌细胞株BT-20增殖及其环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)水平的影响。方法选用甘肃地产猫儿眼(Euphorbia kansui L.),经提取分离制得十二碳烯酸。人乳腺癌细胞株BT-20传代培养后,分别给予0.2、0.6、1.8 mg/L 3个浓度的十二碳烯酸培养48 h作为实验1、2、3组;每孔加5-Fu(10 mg/L,PBS液配制)20μl培养48 h作为5-Fu组;加等量PBS液培养48 h作为空白对照组。用MTT法检测各组细胞的增殖抑制率,用放射免疫法检测各组细胞的cAMP、cGMP含量,观察十二碳烯酸对人BT-20细胞cAMP、cGMP水平的影响。结果经给予不同液体培养48 h后,与对照组(细胞增殖抑制率为0)比较,实验1、2、3组和5-Fu组人乳腺癌细胞株BT-20的增殖抑制率分别为57.15%、75.87%、88.78%和81.73%(P均<0.01);c AMP含量分别增加了13.23%、25.96%、47.59%和34.39%(P均<0.01);cGMP含量分别降低了12.59%、19.29%、33.49%和22.47%(P<0.05,P<0.01);c AMP/c GMP比值分别增加了29.32%、55.77%、121.55%和72.59%(P<0.05,P<0.01)。结论十二碳烯酸具有抑制人乳腺癌细胞株BT-20增殖和升高c AMP/c GMP比值的作用。

脑胶质瘤不同照射方案生物效应的实验研究

目的 通过对人脑多形性胶质母细胞瘤（BT325细胞系）裸小鼠移植瘤不同分割模式照射后生物效应的实验研究,加深对人脑胶质瘤放射反应生物学特性认识,为临床设计照射计划、制定合理分次治疗方案提供实验依据.方法 对BT325细胞系裸小鼠移植瘤进行单次10、20、30、40、60 Gy照射和2 Gy每周5次每天照射、3 Gy每周3次隔天照射、3 Gy每周5次每天照射、4 Gy每周3次隔天照射,总剂量分别为125、114、126、112 Gy.用肿瘤生长曲线评价剂量效应关系并测定肿瘤体积倍增时间.取贴壁生长的指数生长期BT325细胞,用生长曲线测定细胞倍增时间,细胞克隆形成分析法绘制细胞存活曲线（照射剂量为0、1、2、4、6、8、10 Gy）计算曲线参数值,彗星分析法测定DNA单链断裂半修复时间（T1/2）.结果 单次照射各剂量点均不能有效控制肿瘤.2 Gy5次/周和3 Gy3次/周治疗方案对人脑胶质瘤实体瘤也无明显治疗效果.增加分次剂量可使脑胶质瘤实体肿瘤有较明显的消退,其中4 Gy3次/周方案好于其他方案但仍未能达到治愈肿瘤的效果.表明对肿瘤干细胞的控制不理想.各项生物学参数的测定结果：BT325细胞倍增时间为30.16 h,裸小鼠移植瘤肿瘤倍增时间为43 d;细胞存活曲线LQ模型拟合的α=0.360 Gy-1、β=0.057 Gy-2,多靶单击模型拟合的D0=1.394 Gy、Dq=2.127 Gy、SF2=0.714;5 Gy照射DNA单链断裂的T1/2=9.999 min.结论 本实验从实证实验角度印证了临床上脑胶质瘤是一种放射耐受性较高的肿瘤的看法.研究结果提示增高分割剂量有可能提高肿瘤的近期疗效（使肿瘤消退率增加）,但如何提高对肿瘤干细胞的控制还需进一步深入研究.各项生物学参数测定结果提示脑胶质瘤细胞内在放射敏感性较差.