单疱疹病毒结构蛋白BVP22的亚细胞定位及在细胞间的穿梭

背景与目的单疱疹病毒结构蛋白BVP22具有在细胞间穿梭的特性,并能够携带与其融合的蛋白从细胞内合成后穿梭到周围的细胞,克服了基因治疗中转染效率低的问题。本研究的目的是检测BVP22蛋白在细胞中的定位及体内外的穿梭,为将其应用于肺癌的基因治疗提供依据。方法Lipofectamin介导质粒pEYFP和pEYFPBVP22转染肺癌细胞系801D,G418筛选,建立单克隆细胞系。荧光观察确定BVP22的表达及定位。单克隆细胞系与母系801D以一定比例混合培养,采用流式细胞分选计数、免疫细胞化学染色检测BVP22在细胞间的穿梭。建立裸鼠移植瘤,脂质体包裹质粒注入瘤体检测BVP22在实体瘤中的穿梭。结果成功获得单克隆细胞系pEYFP801D和pEYFPBVP22801D。BVP22在细胞中的定位表现出多相性,多数为胞核定位,少数为胞质丝状定位。流式细胞计数显示,随培养时间延长,YFP阳性细胞的比例无明显增加。免疫细胞化学染色显示pEYFPBVP22801D与801D混合培养24h后,几乎所有细胞的胞核都染成了棕黄色;裸鼠移植瘤的免疫组化染色显示注射pEYFPBVP22的肿瘤组织大部分被染成棕黄色。结论BVP22主要定位于细胞核中,其胞核定位可能与细胞分裂及其在细胞间穿梭相关。在体内外BVP22均能够介导与其融合的蛋白在细胞间发生穿梭。

猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究

PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游,使二者融合表达,命名为pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠,分别注射pCD-NA3.1(+)、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2,共免疫2次,间隔2周,分别于首免后2周和二免后4周采血,ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达,将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体,构建了pNORF2和pNBVP22,转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示,通过两次免疫后,各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体,同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果,其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。