犬吉氏巴贝斯虫的人工感染及治疗试验

为进一步证实犬吉氏巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａｇｉｂｓｏｎｉ）的致病作用，筛选较为理想的治疗药物，将１２只杂种狼犬均分为摘脾组与不摘脾组，进行了吉氏巴贝斯虫人工感染试验。人工感染犬临床症状与自然感染犬无明显差异，表现为体温升高、红细胞减少、Ｈｂ降低及虫血症等，摘脾组较不摘脾组虫血症和症状的出现早１～２ｄ。将此１２只人工感染犬及６７只自然感染犬随机分成４组，分别以贝尼尔（Ｂｅｒｅｎｉｌ）、阿卡普林（Ａ－ｃａｐｒｉｎｕｍ）、蒿甲醚（Ａｒｔｅｍｔｈｅｒｉｎ）和磷酸伯氨喹（Ｐｒｉｍａｑｕｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ）４种药物进行治疗比较试验，结果以蒿甲醚疗效最好，用药后第２天虫体转阴率达７０％，第３天Ｈｂ由２８ｇ／Ｌ上升到６４ｇ／Ｌ，奏效迅速。

长角血蜱侵袭致藏獒“蜱麻痹”和巴贝斯虫感染的诊治

对卫辉市某2.5月龄的以后肢麻痹为特征的藏獒进行临床检查、血液涂片染色镜检、血液常规检测、蜱形态学观察和蜱种鉴定。结果表明:藏獒红细胞内有大量犬巴贝斯虫寄生,血液常规检查白细胞数升高,血红蛋白含量正常,感染蜱为长角血蜱。最终确诊为长角血蜱侵袭致藏獒"蜱麻痹"和巴贝斯虫感染。应用伊维菌素、血虫净等药物进行治疗,3d后该犬病情基本好转,血常规检查白细胞恢复正常。

利用BgAMA-1抗原建立吉布森巴贝斯虫的ELISA诊断方法

本研究利用基因重组技术,构建并表达吉布森巴贝斯虫的重组顶膜抗原-1(BgAMA-1),将BgAMA-1作为诊断抗原,建立针对吉布森巴贝斯虫的ELISA诊断方法。结果显示,构建的重组表达质粒得以表达,建立的ELISA方法在血清学诊断中有较好的特异性。

吉氏巴贝斯虫cDNA探针的制备及杂交试验

本实验将－6．6kb的吉氏巴贝斯虫cDNA片段以光照活化法标记光敏生物素，制备成光敏生物素探针。与吉氏巴贝斯虫基因组DNA、伊氏锥虫基因组DNA、大白细胞DNA的斑点杂交试验表明，该探针可与0．001ng以上量的吉氏巴贝斯虫DNA杂交，而不与任何浓度的伊氏锥虫DNA和犬DNA杂交，具有很高的敏感性和特异性。

一例犬吉氏巴贝斯虫感染引起的免疫介导溶血性贫血的诊治

犬免疫介导溶血性贫血是一种与自身红细胞抗体有关的溶血性贫血,发病原因可分为原发性和继发性,论文主要介绍了一例由吉氏巴贝斯虫感染后继发的犬自身免疫溶血性贫血的诊断、治疗和预后。

克隆表达的犬吉氏巴贝斯虫重组GST-P130kDa用于血清学诊断

利用抗体法(picoBlueTMImmunscreeningKit,应用B.gibsoni感染血清)从犬吉氏巴贝斯虫(B.gibsoni)裂殖子mRNA制备的吉氏巴贝斯虫cDNA文库中进行免疫筛选,选出目的基因相cDNA片段(阳性克隆)。测序验证后将该cDNA(基因)克隆至原核表达载体pGEX4T3,构建重组质粒,在大肠杆菌E.coli(DH5a)中以GST融合蛋白的形式表达(SDSPAGE分析证明);表达产物为130kDa的可溶性融合蛋白。免疫学分析(Westernblot和ELISA)结果表明,犬吉氏巴贝斯虫重组GSTP130kDa融合蛋白(rBgGSTP130kDa)能与犬吉氏巴贝斯虫(B.gibsoni)感染血清起反应,且与犬巴贝斯虫(B.canis)无交叉反应。本试验利用犬吉氏巴贝斯虫重组BgGSTP130kDa融合蛋白(作为重组抗原)检测巴西(n=310)、日本(n=100)和中国(n=114,n=30)等国随机采集的自然感染狗血清,其结果为巴西狗血清阳性率为55%、日本为8%、中国为1～9%;其结果与间接荧光抗体法(IFAT)结果为一致(作为验证)。结果表明重组BgGSTP130kDa融合蛋白具有较强的免疫原性和特异性,可用于吉氏巴贝斯虫病的诊断,这为吉氏巴贝斯虫病的早期诊断和深入研究犬吉氏巴贝斯虫病的特异性重组抗原及重组疫苗奠定基础。

巴贝斯虫病在南京宠物犬中流行情况的调查

通过对南京市部分宠物门诊2002年8月-2005年8月3年病例的不完全统计、分析,犬巴贝斯虫病在南京市区一年四季均可发生。其中,秋季最多,春季次之,冬季偶尔可见;5月和10月高发,形成全年的双峰曲线。传播媒介主要为血红扇头蜱。犬巴贝斯虫病的发生与环境气候因素、人类活动有密切关系。

吉氏巴贝斯虫cDNA文库的构建

用离心柱层析法除去以反转录合成的吉氏巴贝斯虫双链ｃＤＮＡ的短片段，加ＥｃｏＲＩ粘性末瑞，再以ＮｏｔＩ酶切，定向克隆到λｇｔ１１Ｓｆｉ－ＮｏｔＩ载体ＤＮＡ的ＬａｃＺ基因内。体外包装后，感染Ｙ１０９０菌，构建成含３．２８×１０５个重组子的表达型吉氏巴贝斯虫ｃＤＮＡ文库。酶切鉴定表明，白斑噬菌体ＤＮＡ均含有大小不等的ｃＤＮＡ片段，免疫学筛选显示文库中表达阳性的重组子数占总重组子数的８．９％。

吉氏巴贝斯虫实验动物模型的研究

用吉氏巴贝斯虫感染置换了犬红细胞的 SCID鼠 ,吉氏巴贝斯虫在 SCID鼠体内得到高水平的生长和增殖。虫体大小比在犬体内略增大 ,而且繁殖型虫体增多 ,常在一个红细胞内寄生有 2、4、8、16和 32个虫体。在感染的第 10天前后 ,末梢血液中红细胞的染虫率高达 12 %左右。从 SCID鼠末稍血液能检出虫体的期限为 15～ 18天左右。从而成功地建立了吉氏巴贝斯虫的实验动物模型。

吉布森巴贝虫顶膜抗原-1基因的表达及表达产物的生物学活性

通过免疫筛选法,从构建的犬吉布森巴贝虫cDNA基因表达文库中筛选到1个cDNA克隆,此cDNA核苷酸全长2 108 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码蛋白的分子质量约为62 ku。经过分析,此蛋白(BgAMA-1)与其他巴贝虫属的顶膜抗原-1具有较高的同源性。为了研究其生物学活性,以此cDNA为模板,利用PCR扩增BgAMA-1的全基因,并将其克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了原核表达载体pGEX-4T-3/BgAMA-1。通过Western-blotting对表达并纯化的重组蛋白的生物学活性进行分析。结果显示,构建的pGEX-4T-3/BgAMA-1能在大肠杆菌DH5α中表达,所获的重组抗原BgAMA-1在Western-blotting上仅与吉布森巴贝虫感染犬血清发生反应,证实其具有种特异性,在诊断方面可能有一定的应用价值。

吉氏巴贝斯虫单克隆抗体制备的研究

应用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞株 ,经间接萤光抗体法筛选和克隆 ,获得了 5株能稳定分泌吉氏巴贝斯虫特异性抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为C3B5、M8B7、E9C5、G6 D8、H2 A7。经过鉴定 ,这 5株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类及相对分子质量分别为IgG2b,1 8× 1 0 4 ;IgG2a,1 8× 1 0 4 ;IgG1 ,1 8× 1 0 4 ;IgM ,3 2× 1 0 4 ;IgM ,1 8× 1 0 4 。腹水效价为 1∶1 0 4 ～ 1∶1 0 5。其中E9C5杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体是一种保护性抗体 ,经对实验感染吉氏巴贝斯虫小鼠体内虫体的杀虫试验证明具有较强的杀灭作用。

一例犬吉氏巴贝斯虫病的诊治

随着家庭宠物犬养殖数量的急剧增加,犬吉氏巴贝斯虫的发病率也随之升高,患犬如治疗不及时可在数日内因贫血死亡,严重威胁犬只生命安全。本文就一例苏格兰牧羊犬感染吉氏巴贝斯虫病的诊治做一介绍,为临床提供参考。

犬吉氏巴贝斯虫截短型抗原BgTRAP的重组表达及其在诊断上的初步应用

吉氏巴贝斯虫Bg TRAP蛋白是一个重要的诊断抗原候选分子。为建立一种实用的犬吉氏巴贝斯虫血清学诊断方法,本研究选取Bg TRAP C-末端跨膜区前,包含TSP功能区和抗原区的411个氨基酸的编码基因片段,重组表达了一个可溶性截短型Bg TRAP抗原,解决了完整蛋白重组表达纯化的困难。免疫荧光试验表明,截短型抗原具有良好的抗原性。纯化的截短型抗原作为酶联免疫试验诊断抗原,可清晰地区分阴性及阳性犬血清,并与其他病原感染无交叉反应,具有良好的特异性。犬感染吉氏巴贝斯虫系列血清检测表明,该抗原可检测早期感染(4 d)和感染200 d以后的样本。结果提示,重组Bg TRAP截短型抗原可作为一种诊断制剂检测犬吉氏巴贝斯虫抗体。

三氮脒药物治疗对吉氏巴贝斯虫线粒体Cyt b基因的影响调查

旨在检测患病犬经三氮脒治疗后,吉氏巴贝斯虫线粒体细胞色素b(Cyt b)是否存在基因突变。调查了2010至2020年犬巴贝斯虫病的流行情况,收集了11份自然感染吉氏巴贝斯虫且接受三氮脒治疗的患犬血液样品,采用蛋白酶K消化,苯酚提取法提取血液中基因组DNA,设计引物,通过PCR扩增吉氏巴贝斯虫Cyt b基因片段并进行测序分析。调查发现,自2010年以来,通过三氮脒治疗的吉氏巴贝斯虫病的疗程逐渐延长,复发率也逐渐增加。在11份血样中,吉氏巴贝斯虫的Cyt b基因彼此之间相似性高达99.65%~100%,与日本分离株也有较高的同源性(99.18%~99.54%)。在Cyt b基因nt363基因位点上没有发现基因突变。这些结果说明虽然吉氏巴贝斯虫对三氮脒逐渐产生耐药,但三氮脒对吉氏巴贝斯虫Cyt b基因并不产生影响。

一例犬吉氏巴贝斯虫病的诊治

3岁雄性贵宾犬,体重3.20 kg,免疫完全,未绝育,从未进行过体内外驱虫,院内散养。主诉最近2周发现犬的精神状态渐差,进食量逐渐减少。为了对其进行诊治,采用体格检查、血液学检查以及影像学检查的方法进行诊断,并根据诊断结果进行治疗,结果表明,该犬感染吉氏巴贝斯虫且并发肝脏损伤,通过采取输血、驱虫等治疗措施,患犬的临床症状消失,镜检外周血虫体消失,治疗后未见复发。说明临床上可通过血液学检测对犬的吉氏巴贝斯虫感染进行确诊,且输血结合驱虫治疗可有效治疗该病。

西安市宠物犬吉氏巴贝斯虫病病例的统计分析

为进一步了解犬吉氏巴贝斯虫病的发病规律和临床表现,本试验对61例西安市某动物医院犬吉氏巴贝斯虫病确诊病例进行统计分析。结果显示,该病可在多个品种、不同年龄段的犬只中进行传播,其中1~3岁易感性更高;犬只在一年四季均可感染该病,其中秋季更易感;该病的临床症状主要表现为黏膜苍白、黏膜黄染、血红蛋白尿、高热和脾肿大;患犬血涂片检查均可在红细胞内观察到吉氏巴贝斯虫虫体,部分可见异常红细胞;多数患犬在临床检查中都会出现红细胞压积(HCT)、血红蛋白(HGB)浓度、红细胞(RBC)数和血小板(PLT)数降低的现象;部分患犬还会出现炎症感染,肝、肾损伤和离子紊乱等情况。该结果为犬吉氏巴贝斯虫病的临床诊断提供了可靠的数据参考,对提升该病的诊断效率有一定的临床意义。

边境牧羊犬感染吉氏巴贝斯虫的诊断和治疗

犬巴贝斯虫病是经蜱传播的血液原虫病,是由寄生于犬红细胞中的巴贝斯虫引起的。该病临床症状主要为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等,严重时可导致死亡。因此,对于犬巴贝斯虫病的诊断与治疗刻不容缓。本文对重庆动物医院接诊的一例患病犬进行临床观察以及血常规、PCR等实验室检测,最终确诊为犬吉氏巴贝斯虫病。经过治疗后,患病犬病症趋于好转,两周后完全康复。为犬吉氏巴贝斯虫病的诊断和治疗提供了参考。

吉氏巴贝斯虫多个GPI锚定蛋白基因的筛选与生物信息学分析

吉氏巴贝斯虫是一类红细胞内专性寄生的血液原虫,犬一旦感染终生带虫,治疗后时有复发,因此需要简便快捷的临床诊断方法及时确诊治疗。GPI锚定蛋白是虫体表面重要的抗原分子,是很好的潜在诊断标识,在虫体粘附、识别以及入侵红细胞等过程中具有非常重要的作用。为了筛选吉氏巴贝斯虫GPI锚定蛋白基因,通过搜索NCBI、Uniprot以及PiroplasmaDB数据库中吉氏巴贝斯虫表面抗原,与武汉株吉氏巴贝斯虫数据库作比对,筛选出可能的吉氏巴贝斯虫武汉株的GPI锚定蛋白基因,并通过bigPI、PredGPI、GPI-SOM网站预测其GPI锚定位点。运用生物信息学分析软件预测其氨基酸信号肽、跨膜区、疏水区以及结构域和抗原表位等,分析其生物信息特性。通过分析确定了5个吉氏巴贝斯虫武汉株的GPI候选抗原,分别命名为BgP50-WH、BgP47-WH、BgP45-WH、BgP32-WH、BgP12-WH,其GPI锚定位点均位于C端,长度约为21~22个氨基酸,均有信号肽并含有4个抗原表位。分析结果表明,这5个GPI抗原均有望成为吉氏巴贝斯病的诊断标识,其中BgP47-WH和BgP50-WH与抗体亲和力最强,最具有成为诊断标识的潜力。

1例三氮脒结合3种抗生素联用治疗犬吉氏巴贝斯虫病例报告

患犬由于食欲减退前来就诊,在体格检查结果前提下通过实验室仪器检查及影像学排查确定贫血为造成患犬临床症状的病理性因素。围绕贫血原因,依托细胞学检查结果及PCR检查确诊为吉氏巴贝斯虫感染。在本病例中尝试使用强力霉素、恩诺沙星、甲硝唑3种抗生素连用配合兽用三氮脒进行治疗,持续治疗近3个月后可控制感染,但很快出现复发,后通过传统治疗方案控制病情。该文最后针对不同的吉氏巴贝斯虫治疗方案结合病例具体情况进行比较和讨论,得出强力霉素、恩诺沙星、甲硝唑3种抗生素联用不适合作为吉氏巴贝斯虫治疗的首选方案,具体疗效需要更多数据支撑。

长角血蜱成蜱的毛细管和生物膜2种人工饲喂技术的建立与初步应用

为开发硬蜱人工感染技术以便于探索其与病原体之间的共生机制及传播机制,本研究将长角血蜱成蜱分为3组,分别为经毛细管饲喂后叮咬小鼠、小鼠体表叮咬后进行生物膜饲喂和小鼠体表叮咬至饱血3种方式,其中小鼠体表叮咬至饱血为对照组。对饱血蜱体重、孕卵期和产卵量,以及3种饱血方式下蜱的存活率、饱血率和产卵率进行分析,最终建立了针对长角血蜱成蜱的毛细管饲喂和生物膜饲喂技术。同时,通过该技术为长角血蜱饲喂吉氏巴贝斯虫,完成了两种长角血蜱饲喂方式在吉氏巴贝斯虫蜱传性评价的初步应用。结果表明:1)毛细管饲喂后接小鼠体表叮咬的饱血方式在饱血成蜱体重、孕卵期和产卵重量3个指标上与对照组相比差异不显著(P>0.05),但在饱血率上低于小鼠生物膜饲喂和小鼠饲喂两种饱血方式。2)生物膜饲喂在产卵率和产卵重量方面略逊于对照组(P<0.05),但是在成蜱饱血后体重和孕卵期上与对照组相比差异不显著(P>0.05),饲喂成活率也与对照组一致。3)吉氏巴贝斯虫在长角血蜱成蜱吸血初期和后期均能够入侵卵巢并进入子代虫卵内。综上,本研究建立了长角血蜱毛细管和小鼠生物膜2种饲喂方式,并初步应用于吉氏巴贝斯虫的蜱传性研究。2种人工饲喂方式为探索蜱传病原体与媒介蜱的互作关系,开发杀蜱疫苗和药物筛选提供了技术平台。