Synthesis of 14-Bromo and 14-Hydroxy Baccatin III Derviatives

Several 14 alpha- and 14 beta -bromo baccatin III derivatives were synthesized by direct bromination and from silyl enol ether of 13-oxo-7-TES-baccatin III. 14 beta -Hyroxy baccatin III derivative was also obtained from the same silyl enol ether.

Identification of missing CYP450 enzymes involved in paclitaxel biosynthesis and heterologous reconstitution of baccatin III

Paclitaxel,a tetracyclic diterpenoid,has garnered attention for its potent anti-cancer properties and intricate molecular structure,making it a significant target for chemical synthesis and biosynthesis[1].However,its natural sources are extremely limited,as it is derived exclusively from the bark of endangered genus Taxus plants,which contain paclitaxel in very low concentrations(0.01%−0.05%)[2-3].Recent advances in synthetic biology present promising opportunities to enhance paclitaxel levels in Taxus cell cultures or to enable the reconstitution of its production in heterologous hosts,such as yeast or tobacco(Nicotiana benthamiana).

苯丙氨酸、蔗糖和甘露醇对杂种红豆杉细胞的生长及形成紫杉醇、巴卡亭III和10-去乙酰基巴卡亭III的影响

研究了苯丙氨酸、蔗糖和甘露醇对杂种红豆杉悬浮细胞的生长及形成紫杉醇、巴卡亭ＩＩ和１０去乙酰基巴卡亭ＩＩ的影响。结果表明，培养基中添加１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１或２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１苯丙氨酸和在培养２８ｄ时同时补加７３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１蔗糖和１３７３ｍｍｏｌ·Ｌ－１甘露醇能显著地促进细胞的生长和这３种紫杉烷的形成。同对照相比，有苯丙氨酸又补加蔗糖和甘露醇的细胞生物量增加了０６～０８倍，紫杉醇的产量增加了９～１０倍，巴卡亭ＩＩ的产量增加了２５～３０倍，１０去乙酰基巴卡亭ＩＩ的产量增加了７倍。在培养２８ｄ时补加７３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１蔗糖能显著地促进细胞的生长，但对细胞中这３种紫杉烷的含量没有显著的影响。

利用响应面法优化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件

10-脱乙酰基巴卡亭III(10-DAB)是紫杉烷类抗肿瘤药物多烯紫杉醇的前体物质。采用响应面法优化成团泛菌P2-A-8转化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件。利用Box-Behnken试验和方差分析,从菌体培养时间、菌体浓度OD600、底物终浓度、转化温度、转化时间5个方面优化成团泛菌P2-A-8转化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件。结果表明,获得最佳转化工艺条件为:菌体经过二级培养12 h,转接后调节初始OD600为3.0,此时,加入溶解于甲醇的巴卡亭III溶液,使其终浓度为0.007 mg/m L,32℃,200 r/min下转化4 d,此时10-DAB的生成率达到24.5%,比优化前提高了446.8%。实验结果表明,响应面法优化成团泛菌P2-A-8转化巴卡亭III生成10-DAB的工艺条件合理可行。该研究成果对于多烯紫杉醇生物合成具有重要的应用价值。

产紫杉醇内生真菌MHZ-32的鉴定

从曼地亚红豆杉树皮内表皮分离获得一株内生真菌MHZ-32,通过高效液相色谱法检测发现,内生真菌MHZ-32的紫杉醇提取物中含有与紫杉醇标品(15.02 min)、巴卡亭Ⅲ标品(7.07min)保留时间相近的色谱特征峰.进一步通过质谱法检测发现,MHZ-32的紫杉醇提取物中具有与紫杉醇标品((M+Na)+=876)、巴卡亭Ⅲ标品((M+Na)+=609)相同的质谱特征峰,表明内生真菌MHZ-32可以产紫杉醇和巴卡亭Ⅲ.其紫杉醇和巴卡亭III的产量分别约为0.6μg/g和0.2μg/g(紫杉醇或巴卡亭Ⅲ/菌丝干重).并通过18S rRNA序列分析和形态学鉴定,将内生真菌MHZ-32初步鉴定为拟茎点霉属(Phomopsis sp.)真菌.

分子模拟对接和定点突变提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶的活力

【目的】提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶(DBAT)活力,从而更高效地体外酶促合成巴卡亭Ⅲ。【方法】通过DBAT与其天然底物乙酰Co A的计算机分子模拟对接,选定C165W、N300I、F160C 3个氨基酸残基进行单点定点突变。突变基因经大肠埃希菌重组表达,突变重组酶特性经体外酶促反应测定。【结果】3种突变重组酶的相对分子质量为67 000;最适反应温度均为32.5℃,与野生酶DBAT一致;DBAT^(F160C)与DBAT的最适反应pH为7.5,略高于DBAT^(C165W)和DBAT^(N300I)的最适反应pH(7.0);DBAT^(C165W)、DBAT^(F160C)和DBAT^(N300I)的比活力与DBAT相比分别提高了61.5%、59.6%和19.2%,催化效率分别提高了55.4%、35.1%和2.9%,3种突变酶的米式常数(K_m)和最大反应速率(v_(max))均高于DBAT。【结论】疏水突变导致突变酶的比活力相比野生型均有显著提高,研究结果为体外高效酶促合成紫杉醇化学半合成的直接前体物巴卡亭Ⅲ奠定了基础。

基于指纹图谱结合化学模式识别对不同发酵程度曼地亚红豆杉曲的质量评价

目的建立曼地亚红豆杉Taxus×media曲指纹图谱,对曼地亚红豆杉曲质量控制和资源开发提供科学依据。方法采用HPLC法建立45批曼地亚红豆杉曲的指纹图谱,通过对照品比对,对共有峰进行指认,确定并建立7种有效成分含量的测定方法。在指纹图谱基础上,结合聚类分析、主成分分析及正交偏最小二乘法-判别分析等筛选出不同发酵程度曼地亚红豆杉曲间差异性标志物。结果45批曼地亚红豆杉共有32个共有峰,指认了18种成分,相似度均大于0.9。通过聚类分析将不同发酵程度曼地亚红豆杉曲分为5类,主成分分析提取了4个主成分;综合分析筛选10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇、7-表紫杉醇、银杏双黄酮、金松双黄酮作为曼地亚红豆杉曲的质控成分,质量分数范围分别为0.0715~0.1237、0.1245~0.1171、0.1135~0.1261、0.1225~0.1627、0.0710~0.0893、0.8091~1.1102、1.0031~1.9948 mg/g。结论建立的指纹图谱及多成分含量测定方法专属性强,稳定,可靠,为曼地亚红豆杉曲的质量控制及资源开发提供参考。

产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉MD2的发酵条件优化

【目的】通过优化内生真菌枝状枝孢霉MD2的发酵条件,提高10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)和紫杉醇(Taxol)的产量。【方法】采用单因素试验分析不同的培养基初始pH值、培养温度、摇床转速和培养时间对10-DAB和紫杉醇产量的影响,优化枝状枝孢霉MD2的培养条件;以YES为基本培养基,采用单因素试验和正交试验分析添加苯甲酸钠、苯丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸4种前体物对10-DAB和紫杉醇产量的影响,优化枝状枝孢霉MD2的培养基组分。【结果】优化后发酵条件为:在初始pH为5.0的300 mL YES培养基中,添加15 mg/L苯甲酸钠、25 mg/L苯丙氨酸、5 mg/L丝氨酸、15 mg/L甘氨酸,接种1 mL枝状枝孢霉MD2的孢子悬液(107 108个孢子/mL),28.0°C、220 r/min发酵培养12 d。在此条件下,枝状枝孢霉MD2的生物量、10-DAB和紫杉醇的产量分别为15.5 g/L、471.5μg/L和569.5μg/L,与初始发酵条件相比,分别提高了1.3、3.6和3.4倍。【结论】首次获得了枝状枝孢霉MD2生产10-DAB和紫杉醇的较适摇瓶发酵条件,可为进一步放大发酵培养提供参考。