Bacillus subtilis B2产1-脱氧野尻霉素(DNJ)发酵条件优化

为探索制备含有1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojimycin,DNJ)的降血糖功能性食品的新方法,以产DNJ的菌株Bacillus subtilisB2为初始菌株,以价廉的农产品加工副产物豆渣为原料,通过对发酵条件的优化,获得富含功能因子DNJ的发酵液。结果表明:接种量对α-葡萄糖苷酶抑制活性影响不明显,当接种量大于104个/mL时,发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性均在20以上。而豆渣浓度、发酵温度、培养基初始pH值及发酵时间对发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性影响较大,在豆渣质量浓度30mg/mL,初始pH值6～8,发酵温度40℃的条件下发酵48h,发酵液表现出较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。以Bacillus subtilisB2发酵豆渣的发酵液为原料开发含DNJ的降糖功能食品,可以大大提高豆渣的利用价值,为降糖功能食品的开发利用开辟新途径。

Bacillus subtilis fmbj与2-脱氧葡萄糖协同作用对Rhizopus stolonifer的生物防治效果

【目的】通过添加佐剂2-脱氧葡萄糖(2-DOG)的方法提高拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis fmbj)菌株的生防效果。【方法】分别在PDA平板和水蜜桃上测定2-DOG对拮抗菌B.subtilis fmbj和病原菌桃软腐病菌葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)生长的影响及B.subtilis fmbj与不同浓度2-DOG协同作用对R.stolonifer的防治效果。【结果】平板试验表明,2-DOG浓度仅为0.3 mg.mL-1时,可完全抑制R.stolonifer的生长;而2-DOG高达20 mg.mL-1,B.subtilis fmbj依然存活,表现出对2-DOG有较高的耐受性。桃上接种试验发现,单独使用浓度为3.9×108 CFU/mL B.subtilis fmbj时,桃果实发病率为30%;4 mg.mL-1 2-DOG单独使用时桃果实发病率为35%;而当4 mg.mL-1 2-DOG和3.9×107 CFU/mL B.subtilis fmbj配合使用时,可完全抑制果实的腐败。【结论】拮抗菌B.subtilis fmbj和2-DOG协同作用比单独使用对桃果实软腐病的防治效果明显,该研究结果为桃果实采后病害控制和保藏提供了有效的方法与途径。

枯草杆菌Bacillus subtilis降解3-羟基丁酮酶系统基因的分子克隆研究(英文)

以粘粒 pBluescriptSK -为载体 ,构建了枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 16 8PstI酶切的部分基因文库。用从梭状芽孢杆菌Clostridiummagnum分离的DNA片段作为异源探针 ,通过原位杂交 ,从文库中筛选出两个含有 4 .2kbpPstI DNA的重组克隆菌株 ,分别命名为 pSKP4 2 0和 pSKP4 2 1.分析研究表明 ,该克隆DNA片段包含有编码降解 3 羟基丁酮酶系的基因。限制性酶切分析证实 ,该基因片段在这两个克隆中插入载体的方向正好相反。

Bacillus subtilis自然感受态缺陷株蛋白质表达谱的初步分析

利用蛋白质双向电泳对枯草芽孢杆菌自然感受态缺陷突变株BR151pm感受态形成期的全细胞蛋白质进行比较分析,发现有28个蛋白质斑点出现变化。利用基质辅助激光解析/电离串联飞行时间质谱对其巾2个明显缺失的蛋白斑点进行分析鉴定,确定这2个蛋白质分别为直接参与自然感受态形成的Nin蛋白和RecA蛋白,进一步确证了BR151pm为自然感受态缺陷突变株。

枯草芽孢杆菌PW2挥发性产物对黄曲霉的抑制作用

为探寻安全、高效的黄曲霉新型抑制物,采用顶空固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GC-MS)技术对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PW2所产具有抗霉活性的挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs)进行了成分鉴定,并利用平板对扣法从鉴定出的成分中筛选具有强抗霉活性的目标化合物,通过平板对扣法和96孔板梯度稀释法测定目标化合物对黄曲霉的最小抑菌体积分数(MIC),使用黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))ELISA检测试剂盒分析了目标化合物对黄曲霉产AFB_(1)的抑制作用,使用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察受试黄曲霉孢子形态的变化和采用分光光度法测定受试黄曲霉细胞膜麦角甾醇相对含量,以探讨抗霉机理。结果显示,从PW2所产VOCs中共鉴定出41种组分,并从中筛选出异辛醇为目标化合物;平板对扣法和96孔板梯度稀释法测得异辛醇对黄曲霉的MIC分别为0.169μL/mL和6.25μL/mL;PDB培养基中异辛醇体积分数分别为3.13、6.25、12.50μL/mL时,均能有效抑制AFB_(1)的产生,且随异辛醇体积分数的升高,抑制效果增强;异辛醇处理可导致黄曲霉孢子表面凹陷和孢子破裂,并且影响细胞膜中麦角甾醇的相对含量,造成细胞膜受损。该研究可为开发以异辛醇为功能成分的黄曲霉抑制剂提供理论参考。

枯草芽孢杆菌DC-1产维生素K_(2)的发酵条件优化

为提高微生物发酵法生产维生素K_(2)的产量和多样性,对枯草芽孢杆菌DC-1的发酵条件进行优化。采用单因素试验对其发酵条件包括碳源、氮源和无机盐进行初步优化,通过Plackett-Burman(PB)试验筛选出对DC-1产维生素K_(2)具有显著性影响的因素,应用响应面Box-Behnken设计优化获得DC-1的最优发酵条件。结果表明,DC-1产维生素K_(2)的最优发酵条件为甘油添加量36.5 g/L、糖蜜添加量31.8 g/L、黄豆粉添加量32.5 g/L、KH2PO_(4)浓度0.3 g/100 mL、K_(2)HPO_(4)·3H_(2)O浓度0.8 g/100 mL、Mg SO_(4)·7H_(2)O浓度0.7 g/100 mL、Na Cl浓度0.5 g/100 mL。在该条件下,MK-7产量达到94.66 mg/L,比初始发酵条件提高了48.04%;同时菌株DC-1产维生素K_(2)的多样性增加,经液相色谱-质谱联用(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)鉴定能同时产5种MK同系物,分别为MK-2、MK-3、MK-4和MK-7,其中一个类似物未能在高分辨率质谱中找到,根据保留时间推测其为MK-5或MK-6,可为维生素K_(2)的工业化生产和探索维生素K_(2)同系物的生物活性奠定基础。

蜡样芽孢杆菌对邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的降解特性研究

选择邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)作为目标污染物,采用实验室前期从九溪人工湿地植物香蒲(Typha Linn)根际土中富集驯化分离的DEHP降解菌X41作为供试菌株,通过对其形态、生理生化特征及16S rDNA序列进行分析,初步鉴定菌株X41为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。采用正交试验研究菌株X41对DEHP最佳降解条件和降解特性。结果表明,菌株X41在pH为6.0,温度为35℃,接菌量为3%,DEHP初始质量浓度为300 mg/L的环境条件下降解效率最高,且在此最优降解条件下,菌株X41生长良好,生长曲线呈“S”型,7 d的DEHP降解率高达99.54%。实验结果可为人工湿地中DEHP的去除提供一定的科学依据。

内生枯草芽孢杆菌BS-2防治荔枝霜疫病及其生化机理

研究内生枯草芽孢杆菌BS-2(Bacillus subtilis)菌株对荔枝采后果实霜疫病的防治效果,及其对体内活性氧代谢(SOD、POD、CAT、MDA、超氧阴离子自由基的产生速率)和病程相关蛋白(β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性)等的影响。结果表明,BS-2菌株对荔枝霜疫病具有较好的防治效果,接种处理后6d,其防治效果为37.83%;经内生细菌处理的荔枝果皮的β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性、CAT和SOD酶活性均比病菌处理的高,而POD、PPO酶活性以及膜透性、MDA含量与超氧阴离子自由基的产生速率却比病菌处理的低。当接种后6d,经内生细菌处理的荔枝果皮的β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性和SOD酶活性分别比病菌处理的高70.73%、30.76%和297.43%;而POD、PPO酶活性和超氧阴离子自由基的产生速率却分别比病菌处理的低15.11%、4.96%和28.95%。

枯草芽孢杆菌PW2产挥发性物质对赭曲霉的抑制作用

采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PW2菌株所产抗霉活性挥发性物质(volatile compound,VC)进行成分鉴定,选取所鉴定出的单个成分采用平板对扣法测定其对赭曲霉(Aspergillus ochraceus)的抑制率,以活性最强的VC作为关键抗霉挥发性物质(key antifungal volatile compound,KAVC),进一步研究KAVC对赭曲霉生长和产毒的作用效果及机理。结果表明:PW2菌株所产VC中鉴定出酯、醛、烷烃、醇、酮、酸、烯烃等41种成分,单个成分抗霉实验发现异辛醇对赭曲霉的抑制活性最强。在接触条件下异辛醇剂量为1562.5μL/L时可以完全抑制赭曲霉生长,且使赭曲霉毒素A含量降低23.67%。在挥发条件下异辛醇剂量为112μL/L时可以完全抑制赭曲霉生长,281μL/L时可以完全杀死赭曲霉。经异辛醇处理后的赭曲霉孢子外观褶皱、凹陷和干瘪,且细胞膜完整性被破坏,菌丝麦角甾醇含量降低了42.68%~65.40%,胞内核酸和蛋白泄漏。说明异辛醇能够通过破坏赭曲霉细胞膜抑杀赭曲霉,可为其在食品防霉中的应用提供理论依据。

重组枯草芽孢杆菌全细胞催化高效合成2′-脱氧腺苷

以枯草芽孢杆菌168(简写为BS)为宿主,以脱氧胸苷和腺嘌呤为底物,异源表达组合来源于大肠杆菌(E.coli)的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)与嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)作为催化酶源,全细胞催化合成2′-脱氧腺苷(dA)。首先,以BS敲除内源性的PNP(由基因deoD编码,Gene ID:940038)后的菌株BS0为出发菌株,经过PyNP1酶(来源于E.coli,Gene ID:948901)与PNP3酶(来源于E.coli,Gene ID:945654)的重组表达得到CW3,再优化PyNP1与PNP3的对核糖体结合位点(RBS)序列得到重组菌株CW3-3,在CW3-3作用下,dA的产量为133.4 g/L,脱氧胸苷的转化率为64.3%;其次,以CW3-3为出发菌株,利用互作短肽构建自组装多酶复合物,经过PyNP1酶N端融合RIAD,PNP3酶C端融合RIDD(其中RIAD和RIDD为互作短肽标签)处理后,PyNP1酶N端融合4个RIAD标签得到重组菌株CW17,在其作用下,dA的产量达到179.6 g/L,显著提升了底物转化率;最后,对重组菌株CW17全细胞催化条件细胞添加质量浓度及催化反应温度进行了优化,在细胞添加质量浓度为150g/L,反应温度50℃条件下,dA的产量达到200.3g/L,脱氧胸苷的转化率为96.6%。

二株石斑鱼源芽孢杆菌的生物学特征与益生性研究

为了解从云龙石斑鱼(Epinephelus moara♀×Epinephelus lanceolatus♂)肠道分离出的地衣芽孢杆菌GM-2(Bacillus subtilis GM-2)、枯草芽孢杆菌GM-39(Bacillus licheniformis GM-39)的生物学特征与益生特性,通过对胃肠液、pH、鱼胆汁的耐受性等试验进行生物学特征分析,并通过抑菌作用、黏附性、产酶活性、体外抗氧化等试验进行益生特性研究。结果显示,二株芽孢杆菌经人工胃肠液、5%鱼胆汁溶液分别处理1~3 h处理后,存活率分别达70%以上、80%以上以及50%;经不同pH生理盐水处理30 min后,二株菌的存活率分别从0逐渐提高到87.83%、88.25%;二株菌对18种抗生素均不产生耐药性,血琼脂平板培养均未出现溶血现象,菌悬液分别对6株指示菌有抑制作用;二株菌的自聚率达到30%以上,疏水率居于30%~50%;GM-39对黏液蛋白的黏附性显著强于GM-2;GM-39的产酶活力均高于GM-2;GM-2的羟基自由基清除能力和还原能力强于GM-39,而GM-39的DPPH自由基、超氧阴离子自由基的清除能力优于GM-2。结果表明:二株芽孢杆菌均具备较好的耐受性、安全性、抑菌性、产酶活力和抗氧化能力,因而二株芽孢杆菌均具有益生菌开发潜能,为其后续作为益生菌制剂的研究提供了科学理论依据。

Kinetics of the Action of Na_2SeO_3 on Bacillus subtilis Growth as Studied by Microcalorimetry

Microcalorimetric bioassay for acute cellular toxicity is based on metabolicheat production from cultured cells. The biological response to toxicants is the inhibition of theheat production rate in cells, and toxicity is expressed as the concentration of toxicant that is50% effective to this inhibition (IC_(50)). In this paper, the effect of Na_2SeO_3 on Bacillussubtilis growth was investigated at 37℃ by microcalorimetry. The relationship between growth rateconstants (k) and concentration of Na_2SeO_3(c) shows a logarithmic normal distribution, and IC_(50)is 20.3 μg/mL. All these thermokinetic information is readily obtained by an LKB 2277-204 heatconduction microcalorimeter. Microcalorimetry is a quantitative, inexpensive, and versatile methodfor toxicology research.

多粘类芽孢杆菌BRF-1和枯草芽孢杆菌BRF-2对黄瓜和番茄枯萎病的防治效果

采用室内培养方法，对生防细菌多粘类芽孢杆菌BRF-1和枯草芽孢杆菌BRF-2不同稀释倍数的代谢产物抑制黄瓜尖孢镰刀菌、番茄枯萎病菌分生孢子萌发和菌丝生长的试验结果表明，当两菌株代谢产物稀释5倍时，对分生孢子萌发的抑制率达到80％以上；两菌株代谢产物在稀释2倍和5倍时，对2种病原真菌菌丝生长的抑制率在40％-80％之间，与对照差异极显著（P〈0．01）。盆栽试验表明，BRF-1和BRF-2生防细菌菌悬液及其无菌代谢物对黄瓜和番茄枯萎病不仅具有较好的防治效果，而且具有明显的促进生长作用。

纳豆芽孢杆菌B4对Caco-2细胞活性、黏附与细胞因子分泌的影响

本试验以Caco-2细胞为体外模型研究纳豆芽孢杆菌B4对其活性、黏附与细胞因子分泌的影响。采用台盼蓝排斥试验和乳酸脱氢酶细胞毒性检测研究纳豆芽孢杆菌B4对Caco-2细胞活性的影响;采用荧光标记法评价大肠杆菌K88和霍乱沙门氏菌的黏附性能,并通过竞争、排斥和置换试验检测纳豆芽孢杆菌B4对这2株病原菌黏附的阻断作用;采用酶联免疫试剂盒测定Caco-2细胞分泌的细胞因子含量。结果表明:1)纳豆芽孢杆菌B4对Caco-2细胞存活率无显著影响(P>0.05),且对其无毒害作用。2)纳豆芽孢杆菌B4对大肠杆菌K88和霍乱沙门氏菌黏附Caco-2细胞的黏附率无显著影响(P>0.05),且对这2株病原菌黏附Caco-2细胞无阻断作用。3)纳豆芽孢杆菌B4极显著提高了Caco-2细胞分泌促炎细胞因子增殖诱导配体含量(P<0.01),对白细胞介素-6和白细胞介素-8含量无显著影响(P>0.05),极显著降低了Caco-2细胞分泌抗炎细胞因子白细胞介素-10含量(P<0.01)。综上所述,纳豆芽孢杆菌B4对Caco-2细胞无毒性,对大肠杆菌K88和霍乱沙门氏菌黏附Caco-2细胞无阻断作用,可通过调节Caco-2细胞的细胞因子分泌发挥一定的免疫功能。

抗体工程化微型机器人清除水中新型冠状病毒的研究

由于严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(简称“新型冠状病毒”)(SARS-CoV-2)可在水中保持长时间的稳定性和高度传染性,因此,清除水中的新型冠状病毒成为遏制及阻断其传播的重要途径。该研究采用“点击化学”反应将新型冠状病毒S蛋白的中和抗体P2C-1F11修饰在具有自驱动特性的枯草芽孢杆菌表面,构建了一种抗体工程化微型机器人(antibody functionalized bacteria microrobot,AB-robot)。AB-robot通过P2C-1F11对新型冠状病毒S蛋白的高效靶向作用,对水中新型冠状病毒进行捕获和清除。结果表明,AB-robot在饮用水和自来水等水介质中展示了快速的自驱动能力。以新型冠状病毒假病毒为病毒污染物模型,使用AB-robot后,水介质中病毒清除率高达95%。扫描电镜表征结果显示,AB-robot表面结合了大量的病毒颗粒,进一步表明AB-robot能高效捕获病毒。综上,AB-robot的快速运动和病毒靶向性能促进了其对新型冠状病毒假病毒的即时捕获和高效清除,对防止和阻断水中新型冠状病毒的传播具有重要应用价值。

枯草芽孢杆菌拮抗病原菌黏附和入侵Caco-2细胞的研究

为探讨枯草芽孢杆菌及其培养上清液对产肠毒素大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗黏附作用,本试验将产肠毒素大肠杆菌K88或鼠伤寒沙门氏菌SL1344与枯草芽孢杆菌及其培养上清液先后加到Caco-2细胞上,用活菌计数的方法观察产肠毒素大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及枯草芽孢杆菌黏附Caco-2细胞的情况。结果显示:在排斥、竞争和置换试验中,枯草芽孢杆菌菌体均能够明显抑制K88和SL1344的黏附及SL1344的内化,在竞争试验时K88的黏附减少了71.2%、SL1344的黏附及内化减少了92.9%,但枯草芽孢杆菌的培养上清液只有在竞争试验中才能明显抑制K88和SL1344的黏附及SL1344内化。提示:枯草芽孢杆菌通过与病原菌竞争黏附位点来抑制病原菌对Caco-2细胞的黏附和入侵。

枯草芽孢杆菌BSD-2菌株喷雾干燥工艺优化

为研制生物农药新剂型,利用喷雾干燥法制备浓缩枯草芽孢杆菌BSD-2菌粉。以集粉率和抑菌活性为指标,确定最佳喷雾干燥工艺条件。在发酵液中加入15%β-环糊精作为填料,最佳入口温度为170℃,料液温度为30℃,热风量为20 m3/h,入料流量为15 m L/min。此条件下喷雾集粉率达到25.4%,效价保留率为66%,BSD-2菌体存活率为75%。

枯草杆菌Ki－2－132高表达遗传工程系统的研究

利用芽孢杆菌多效调控基因ｈｐｒ、ｄｅｑＱａ、ｄｅｇＲ、ｄｅｇＵ／５３２（Ｈｙ）等和枯草杆菌Ｋｉ－２－１３２自身的积生孢、感受态相关基因的协调作用，构建了系列的高表达遗传工程宿主。这些宿主对于ＡＰｒＥ都实现了较高水平的表达。其中，由ｈｐｒ和ｃｏｍ、ｓｐｏ等配合的宿主表达ＡｐｒＥ的能力比野生型宿主提高了１００—２００倍。

枯草芽孢杆菌产3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇发酵条件优化

研究以一株从古井窖泥中分离筛选的枯草芽孢杆菌为出发菌株,进行发酵培养成分和发酵条件优化。与静置发酵相比,振荡培养可有效提高菌株发酵液中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的产量;在振荡培养的基础上采用正交试验方法对发酵培养基和培养条件进行了优化。实验结果表明,枯草芽孢杆菌发酵培养的最佳条件为:3mmol/L Mg^(2+),15g/L蛋白胨,150r/min,32℃。与初始静置发酵条件相比,最优条件下3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇(左旋)、2,3-丁二醇(内消旋)的产量分别提高了57.75%、1234.96%、163.33%。

2%强化戊二醛性能的实验室观察及研究

2 %强化戊二醛为戊二醛类复方消毒剂 ,其中加有强化剂、改良剂、增效剂。为了解其杀灭微生物与破坏HBsAg抗原性效果、对金属的腐蚀性、储存稳定性等性能 ,对含有 2 %戊二醛的强化戊二醛的杀灭微生物效果及金属腐蚀性、储存稳定性进行了试验观察。结果表明 ,含 0 5 %的戊二醛作用 5min ,对载体表面的金黄色葡萄球菌杀灭率达99 93 % ;作用 3min对大肠杆菌、白色念珠菌的杀灭率均达 99 91% ;含 1%的戊二醛作用 8h ,对载体表面的枯草杆菌黑色变种芽胞杀灭率达 99 91% ;当戊二醛含量为 2 %时 ,作用 10h可将不锈钢片表面HBsAg的抗原性完全破坏。小牛血清对其杀菌效果有一定影响 ;含 2 %戊二醛的强化戊二醛对四种金属片浸泡 72h ,依据腐蚀速率标准判断 ,对不锈钢片、铝片、铜片、碳钢片均属无腐蚀 ;该样品在 5 4℃、RH >75 %的条件下 ,放置 14d后 ,其有效成分下降率为 5 18%。