苏云金杆菌以色列亚种几丁质酶基因的克隆及序列分析

从苏云金芽孢杆菌以色列亚种 (Bacillusthuringiensissubspisraelensis)中提取基因组DNA ,通过合成 1对特异性引物 ,用touchdownPCR的方法扩增几丁质酶ichi基因序列 (GenBank登录号 :AF5 2 6 379)。ichi序列全长为 2 5 70bp ,含有 1个 2 0 6 7bp的开放阅读框 (ORF) ,编码 6 88个氨基酸 ,推测分子量为 75 79kDa ,等电点pI=5 90的几丁质酶前体。序列和结构比较分析表明 :Ichi氨基酸序列与蜡状芽孢杆菌 (Bacilluscereus) 2 8 9几丁质酶CW、蜡状芽孢杆菌CH几丁质酶B及苏云金芽孢杆菌墨西哥亚种几丁质酶的同源性分别为 97 2 4 %、97 18%、97 6 3% ,而与苏云金芽孢杆菌巴基斯坦亚种的同源性只有 6 3 0 7%。Ichi编码区由分泌信号肽 (46AA)、催化区 (10 5AA)、粘蛋白Ⅲ型同源区 (74AA)及几丁质结合区 (40AA)组成。

球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌以色列亚种杀蚊毒素间的协同作用

本研究测定了分别表达苏云金芽孢杆菌Cry4Aa、Cry4Ba、Cry11Aa、Cyt1Aa和球形芽孢杆菌二元毒素Bin的转化菌株Bt B60 1、Bt B611、Bt B640、Bt U 30和Bt CW 3全发酵培养物两两或两两以上不同组合对抗性库蚊的毒力 ,分析了杀蚊毒素间的协同作用。结果表明 ,Bin和Cry4Aa、Bin和Cry 4Ba间有明显的协同作用 ,此外 ,Cry4Aa和Cry4Ba、Cry4Aa和Cry11Aa。

大肠埃希菌表达苏云金杆菌cryIVD基因杀蚊幼活性观察

目的 :观察表达B .t.icryIVD基因的大肠埃希菌对蚊幼虫的毒效。 方法 :细菌的诱导表达及蚊虫毒效测试。结果 :加入工程菌 48h对淡色库蚊和白纹伊蚊均具有明显的杀灭作用 ,LC50 分别为 2 .3 8× 10 6 、1.6× 10 7个 ml细胞 ,其中对淡色库蚊的杀灭作用要好于对白纹伊蚊幼虫的杀灭效果。结论 :单独表达B .t .

苏云金芽胞杆菌以色列亚种20kDa蛋白质对CytA蛋白溶细胞作用的影响

为了证明苏云金芽胞杆菌以色列亚种２０ｋＤｅ蛋白质对ＣｙｔＡ蛋白溶细胞作用的影响， 根据２０ｋＤｅ蛋白质和ｃｙｔＡ蛋白基因的核苷酸序列，用ＡＭＰＬＩＦＹ程序设计了一套带有酶切位 点的引物，经ＰＣＲ扩增分别获得了２０ｋＤｅ蛋白质和ｃｙｔＡ蛋白基因。将其基因与表达载体 ｐＵＨＥ２４连接并转化到大肠杆菌ＸＬＩ和ＤＨＳ 分别获得含２０ｋＤａ蛋白质基因的克隆子 ＬＺ２９；含ｃｙｔＡ基因的克隆子ＬＺｃｙｔＡ和含有二者基因的重组子ＬＺ２０Ａ．在ＩＰＴＧ诱导下，测定 了不同克隆株基因表达产物对大肠杆菌细胞生长的影响。结果表明：ＬＺ２０的细胞生长不受影 响；ＬＺｃｙｔＡ的细胞被杀死；ＬＺ２０Ａ的细胞生长也不受影响。这表明２０ｋＤａ蛋白质基因与ｃｙｔＡ 蛋白基因重组后，２０ｋＤａ蛋白质基因表达产物可保护ＣｙｔＡ蛋白对大肠杆菌的溶细胞作用，而 巳这种作用并不因不同大肠杆菌受体而改变。

含二元毒素基因的苏云金杆菌重组子晶体蛋白分析及其对蚊幼虫的毒性

通过电转化方法将含球形芽孢杆菌（Bacillussphaericus简称B.s)二元毒素基因的重组质粒pCW2转化野生型苏云金杆菌以色列亚种（B．thuringiensissubsp.israelensis简称B．t．i），获得一株含二元毒素基因的重组菌株B＋CW-1。重组菌株能表达二元毒素及δ-内毒素和CytA毒素，并形成2类位于芽孢孢外膜外的伴孢晶体。B＋CW-1对伊蚊（Aedes）、按蚊（Anopheles）和抗性库蚊（Culex）的毒力明显高于B．s，同时也略高产B.t.i菌株，但其杀蚊谱和杀活性水平同B．t．i相似。未发现二元毒素同B．t．i毒素间的协同作用。

微生物转化淀粉废水制备生物灭蚊剂

采用摇瓶发酵试验探讨了淀粉废水为原料制备微生物灭蚊剂的可行性。结果表明,无需任何预处理工序,淀粉废水可作为微生物灭蚊菌株(Bacillusthuringiensissubsp.israelensis187菌株和Bacillussphaericus2362菌株)的优良发酵培养基。Bti187和Bs2362菌株能在淀粉废水(含固率2.5%)为唯一原料的培养基中正常生长发育,并且产孢产毒。Bti187和Bs2362在淀粉废水发酵42h,活菌数分别可达7.5×108、4.5×108CFU·mL-1;抗热性芽孢数分别可达5.1×108、2.7×108CFU·mL-1,均显著高于常规LB培养基。与LB培养基相比,淀粉废水培养基有利于提高芽孢产率、缩短发酵周期。毒力测定表明,淀粉废水培养42h的Bti发酵液对淡色库蚊和白纹伊蚊的LC50分别为0.78、0.87μg·mL-1,淀粉废水培养42h的Bs发酵液对淡色库蚊和白纹伊蚊的LC50分别为0.70、16.06μg·mL-1,淀粉废水明显有利于Bti187与Bs2362菌株的产毒。本研究不仅为淀粉废水提供了高附加值的处置新途径,而且可显著降低生物灭蚊剂的生产成本,具有广阔的应用前景。

苏云金杆菌以色列亚种杀蚊蛋白Cyt1Aa在离中不粘柄菌中的表达

在蚊幼虫生活水域里的离中不粘柄菌(Asticcacaulis excentricus,Ae)中已成功表达苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis,Bti)杀蚊蛋白基因cry11Aa的基础上,将另一Bti杀蚊蛋白基因cyt1Aa转化入Ae中表达。构建并转化了分别单独含有cyt1Aa基因、及同时含有cry11Aa基因的表达质粒pSODCyt20和pSODCryCyt20,蛋白免疫杂交检测相应的Ae重组子分别表达产生了Cyt1Aa和Cry11Aa蛋白。为了探究Ae(pSODCryCyt20)重组子不能表达cyt1Aa的原因,提取了重组子总RNA、并与同是革兰氏染色阴性的大肠杆菌的总RNA比较,结果显示两者RNA系统显著不同,推测Ae中多个外源基因的表达,可能要求每个基因必需一个启动子。

苏云金杆菌以色列亚种晶体蛋白CryIVD基因的克隆及表达产物的效果测定

目的 克隆、表达苏云金杆菌以色列亚种晶体蛋白CryIVD基因并测定其杀蚊毒效。 方法 采用PCR技术 ,扩增得到CryIVD基因片段 ;通过双酶切及连接反应 ,将该基因克隆入大肠杆菌质粒 pUC18构建重组克隆及表达载体 ;转化E .coliDH5α,提取重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列测定 ;以IPTG诱导表达CryIVD蛋白 ,SDS PAGE分析表达产物并进行杀蚊毒效测定。 结果 CryIVD基因成功克隆并在宿主菌中正确表达 ,表达产物对蚊幼的杀灭毒效测定显示其对淡色库蚊Ⅱ～Ⅲ龄健康幼虫的LC50 为 2 .3 8× 10 6 cells ml,对白纹伊蚊健康幼虫的LC50 为 1.6× 10 7cells ml。 结论 CryIVD基因被成功克隆和表达 ,且其表达产物有明显杀蚊幼活性。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种P19基因的初步研究

以含有Ｐ１９和ｃｙｔ１Ａ基因的以色列亚种７２ＭＤ质粒的９７ｋｂＨｉｎｄⅢ片段为模板进行ＰＣＲ扩增，分别获得Ｐ１９基因和ｃｙｔ１Ａ基因片段。与表达载体ｐＵＨＥ２４连接转化大肠杆菌ＸＬ１，获得３个克隆株。ＬＺ１９含有Ｐ１９基因；ｐＬＺｃｙｔ１Ａ含有ｃｙｔ１Ａ基因；ＬＺ１９Ａ含有Ｐ１９和ｃｙｔ１Ａ两个基因。利用ｃｙｔ１Ａ蛋白质可使大肠杆菌细胞致死的特性，在ＩＰＴＧ诱导下，测定了各克隆基因表达对大肠杆菌有致死作用；ｐＬＺ１９Ａ对大肠杆菌的起始致死作用明显快于ｐＬＺｃｙｔ１Ａ，这种现象可能是Ｐ１９基因促进ｃｙｔ１Ａ基因高表达的结果。

苏云金杆菌cryIVD基因的表达及杀蚊毒效测定

目的 研究苏云金杆菌(B.t.i)cryIVD基因用于蚊虫生物防治。 方法 经IPTG诱导,重组质粒在大肠埃希菌DH5α中进行表达,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹(Western-blot)分析,观察其杀蚊毒效。 结果 经SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异蛋白带的分子质量单位为72 ku,并且该蛋白对蚊虫具有杀灭作用。 结论 在大肠埃希菌中B.t.i cryIVD基因单独表达,并具有杀蚊活性。

Bti的溶血特性及其在Bti制剂毒力检测中的应用

实验利用Bti(苏云金杆菌以色列亚种）对兔红细胞（RBC）的溶血特性，以A541特征光吸收对Bti毒蛋白溶液体积或其对数作回归分析。结果表明：二者具有良好的直线关系。相关系数r≥0．95。方差分析表明：不同梯度的Bti每蛋白溶液处理之间差异极显著，处理内各重复之间差异不显著，同一天内的重复检测没有显著差异。本又给出了Bti制剂毒力检测的参考程度，并就该程度应用于Bti毒力快速检测作了较为详尽的探讨。

食物颗粒和非食物颗粒对苏云金杆菌以色列亚种生物活性的影响

以埃及伊蚊幼虫为材料 ,比较了食物和非食物颗粒对苏云金杆菌以色列亚种致病能力的影响 ,结果表明 :食物 (Pharmamedia)和非食物性颗粒 (活性炭及Carmin)皆能显著提高伊蚊幼虫对苏云金芽胞杆菌以色列亚种商品制剂的抵抗力 ,颗粒物的这种作用与其营养功能无关。

苏云金杆菌对微山湖湿地中华按蚊幼虫的室内生测效果

目的探讨苏云金杆菌以色列亚种(Bti)对中华按蚊不同龄期幼虫的杀灭效果。方法采用幼虫浸渍法,26℃环境下,用浓度为2、4、6、8、10、12、14 mg/L的Bti药液,分别对Ⅰ~Ⅳ龄期的中华按蚊幼虫进行实验测定。结果 Bti对微山湖湿地中华按蚊Ⅰ龄期幼虫杀灭作用最佳。其对中华按蚊Ⅰ~Ⅳ龄幼虫的LC_(50)值分别为6.11、8.03、9.66和10.50 mg/L。微山湖湿地Ⅰ~Ⅳ龄幼虫相对实验室敏感幼虫抗性倍数分别为1.15、1.08、1.11和1.12倍。结论 Bti对微山湖湿地中华按蚊幼虫均有不同程度的杀灭作用,同样浓度下幼虫龄期越小,杀灭效果越显著。而且Bti对微山湖湿地幼虫的杀灭效果与实验室敏感品系相差不大,提示当中华按蚊对化学杀虫剂产生抗性时,应用Bti等生物杀虫剂是较好的选择。

表达蝎毒素AaIT或苏云金杆菌毒素Cyt2Ba的大肠埃希菌杀蚊幼活性及增效剂型测试

目的构建表达蝎毒素AaIT或苏云金杆菌毒素Cyt2Ba的大肠埃希菌,检测重组菌对致倦库蚊和白纹伊蚊II龄幼虫的毒力,并测试不同剂型的增效作用。方法分别将AaIT和Cyt2Ba编码基因克隆于pET28a(+)质粒上,并将重组质粒分别转化BL21 E.coli获得分别表达AaIT和Cyt2Ba的工程菌株,经IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白的表达;测试不同浓度工程菌菌液对于蚊幼虫的杀灭效果;并将有效的工程菌制成干粉剂,检测其干粉末及其配剂对蚊幼虫的杀灭效果。结果 AaIT和Cyt2Ba重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,但AaIT重组蛋白对蚊幼虫不具有毒性。表达Cyt2Ba重组蛋白的工程菌菌液对白纹伊蚊和致倦库蚊幼虫均具有明显的杀灭作用,48 h的LC50分别为3.00×106和1.25×107cells/m L,其中对白纹伊蚊幼虫的杀灭效果要显著优于对致倦库蚊幼虫的杀灭效果(P<0.001),并且表达Cyt2Ba重组蛋白的工程菌干粉末及其配剂均具有较好的杀蚊幼虫效果。当该工程菌干粉末与干酵母粉、小麦粉和白胡椒粉分别按4∶1、1∶1和1∶4比例制成配剂处理蚊幼虫48 h后,结果显示当质量比为1:1时,配剂杀蚊幼效果显著提高(P=0.044),并且白胡椒粉末配剂效果要显著好于干酵母粉和小麦粉配剂(P=0.002)。结论表达Cyt2Ba的重组大肠埃希菌对蚊幼虫具有较好的杀灭作用,合适配剂的使用可以增强其在蚊虫防制中的效果。

利用污泥制备微生物灭蚊剂的研究

以活菌数、芽孢数和毒效为参数,通过摇瓶发酵试验探讨了污泥为原料制备微生物灭蚊剂的可行性.结果表明,在含固率适宜的条件下,污泥是微生物灭蚊菌株Bacillus thuringiensissubsp.israelensis187(简称Bti 187)和Bacillussphaericus2362(简称Bs 2362)的优良产孢产毒培养基.Bti 187和Bs 2362在污泥中发酵42h,活菌数分别可达3.7×108CFU/mL、3.6×108CFU/mL;抗热性芽孢数分别可达2.6×108CFU/mL、3.5×108CFU/mL,均显著高于常规LB培养基.毒力测定表明,在污泥中发酵42h后,Bti 187发酵液对淡色库蚊和白纹伊蚊的LC50分别为1.05μg/mL、0.93μg/mL,Bs 2362发酵液对淡色库蚊和白纹伊蚊的LC50分别为0.69μg/mL和103.4μg/mL.与常规LB培养基相比,杀蚊幼虫毒效显著提高.采用污泥发酵制备微生物灭蚊剂可降低生产成本,且发酵性能优良,为污泥资源化开辟了新途径.

球形芽孢杆菌C_3-41二元毒素基因在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的克隆和表达

球形芽孢杆菌Ｃ３４１是我国分离的一株对蚊幼虫有毒杀作用的高毒力菌株，对库蚊、按蚊幼虫的毒性高于２３６２菌株，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明Ｃ３４１总ＤＮＡ中３５ＫｂＨｉｎｄＩＩ片段上带有４１９和５１４ｋＤ二元毒素基因，该片段由３４７９个核苷酸组成，核苷酸序列同２３６２菌株的二元毒素基因序列完全相同。含二元毒素基因的重组质粒ｐＣＷ１和ｐＣＷ２能在大肠杆菌中表达产生二元毒素蛋白，但表达量低，重组子杀蚊毒性低。无晶体型苏云金芽孢杆菌以色列亚种重组子在其芽孢形成中能产生以晶体形式存在的二元毒素蛋白，其全发酵液和纯化晶体蛋白的杀蚊活性与Ｃ３４１相近。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)发酵液的浓缩工艺研究

通过对苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis,Bti)发酵液浓缩工艺的研究,探索了不同温度对浓缩液有效成分的影响程度,比较了不同浓缩方式、不同干燥方式处理下有效成分的回收率。结果表明,采用真空薄膜浓缩方式最终得到的产物质量是离心浓缩方式得到产物质量的176%,效价回收率提高了36%。

苏云金杆菌CryIVD转基因工程藻不同贮存时间对淡色库蚊不同龄期幼虫的杀灭效果

目的观察苏云金杆菌CryIVD转基因贮存藻对不同龄期淡色库蚊幼虫的杀灭效果。方法大量培养工程藻,干燥后保存,应用不同时间的贮存藻作用于不同龄期淡色库蚊幼虫。结果干燥贮存的工程藻数年后仍有较高的杀蚊毒效,尽管杀蚊毒效较新鲜工程藻有所下降,但在105个/ml数量级不同龄期的幼虫仍有50%以上死亡。对不同龄期淡色库蚊幼虫杀灭效果比较表明,1~3年贮存藻3组比较,在106个/ml数量级浓度的蚊幼虫死亡率差异无统计学意义（F=9.32,P〉0.01）,而贮存1年组和3年组在105个/ml数量级浓度及以下,死亡率差异有统计学意义（F=101.21,P〈0.01）。结论转基因蓝藻在干燥贮存情况下仍能保持毒蛋白的稳定遗传和杀幼虫作用,为今后的现场应用提供更方便的选择。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种水剂对新疆额尔齐斯河下游地区蚋的控制研究

目的调查苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)水剂对新疆额尔齐斯河下游河岸谷盆地区蚋的控制效果。方法 2012-2015年在新疆生产建设兵团第十师185团,通过室内和野外试验测试Bti对蚋的杀灭能力;采用SPSS 19.0软件的Probit回归方法计算半数致死浓度(LC_(50))、90%致死浓度(LC_(90))及其95%CI。结果在实验室条件下,Bti对蚋幼虫的LC_(50)和LC_(90)分别为0.034×10^(-6)和0.118×10^(-6)g/ml;野外大面积施用Bti,12 h对蚋幼虫的杀灭率>83.21%,24 h杀灭率>97.07%;2013-2015年该地区连续施用Bti,蚋成虫数量降低了89.43%。结论 Bti水剂对蚋幼虫有良好的杀灭和防控效果,对新疆额尔齐斯河下游地区蚋成虫的防控效果显著,为野外蚋的生物防治提供了参考依据。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒性蛋白基因的克隆及其原核表达

目的从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bti)以色列亚种中获得cry4B、cry11A和cyt1A3种主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行克隆和原核表达。方法根据GenBank上3种基因的已知序列设计合成引物,应用PCR技术扩增目的基因,克隆入pUC19质粒,阳性克隆质粒经酶切和测序鉴定。将测序鉴定的3种蛋白基因克隆入原核表达载体(pET32c)进行原核表达。结果PCR扩增获得特异性的基因片段,重组质粒经酶切后获得预计大小的基因片段,并测序鉴定。序列结果与已知序列一致。原核表达载体经ITPG诱导,获得预计大小的目的蛋白。结论成功克隆了苏云金芽孢杆菌以色列亚种的3个主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行原核表达。