枯草杆菌Bacillus subtilis降解3-羟基丁酮酶系统基因的分子克隆研究(英文)

以粘粒 pBluescriptSK -为载体 ,构建了枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 16 8PstI酶切的部分基因文库。用从梭状芽孢杆菌Clostridiummagnum分离的DNA片段作为异源探针 ,通过原位杂交 ,从文库中筛选出两个含有 4 .2kbpPstI DNA的重组克隆菌株 ,分别命名为 pSKP4 2 0和 pSKP4 2 1.分析研究表明 ,该克隆DNA片段包含有编码降解 3 羟基丁酮酶系的基因。限制性酶切分析证实 ,该基因片段在这两个克隆中插入载体的方向正好相反。

一株产吲哚乙酸的日本野漆树内生枯草芽孢杆菌生长条件及其促生特性研究

【目的】从日本野漆树(Toxicodendron succedaneum)组培苗分离和筛选了1株产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)的内生细菌(BSH-1),对其进行鉴定并分析其促生特性,为开发微生物肥料提供理论依据。【方法】通过革兰氏染色法观察菌株BSH-1的形态,结合16S rRNA基因序列分析和系统发育分析确定其分类学地位;利用生长曲线法测试菌株BSH-1的适宜生长温度、pH值和NaCl质量浓度;利用Salkowski显色法测定菌株产生IAA的能力;采用不同密度的菌株发酵液分别浸泡水稻、云南松和思茅松种子,通过统计种子萌发率以及水稻幼苗的株高、茎粗、生根数和根长等指标分析菌株的促生特性。【结果】鉴定菌株BSH-1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌在35℃、pH值为7和10 g/L NaCl条件下生长量最大。菌株BSH-1产IAA的能力达到17.27 mg/L;可通过促进水稻幼苗的株高、茎粗和生根数促进植株生长,其中株高和生根数分别比对照高9.0%和20.8%。【结论】枯草芽孢杆菌BSH-1能产生IAA,促进水稻幼苗生长,具有生物菌肥开发潜力。

发酵豆粕生产大豆多肽研究

利用30L发酵罐发酵豆粕,对微生物法生产大豆多肽的工艺进行了研究。结果显示,随着发酵时间的延长,发酵液水解度不断上升,并在发酵后期达到30%左右;发酵液中的多肽含量先增后减,表明发酵进程是按大豆蛋白水解成多肽,多肽水解成游离氨基酸顺序进行。酶活分析表明发酵菌株Bacillus.subtilisSHZ3能同时分泌蛋白酶和羧肽酶,分别水解大豆蛋白和肽链末端的疏水性氨基酸,使大豆蛋白的水解和多肽的脱苦在发酵过程中一步完成,生产出不苦的大豆多肽。凝胶层析表明,随着发酵时间的延长,发酵液中肽链变短,24h发酵所得主要为300～1000Da具有潜在生物活性的短链肽。

微生物发酵法生产利巴韦林的初步研究

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TM903(Ade–+8-AGr+MSOr)为生产菌株,考察了前体物1,2,4-三唑-3-甲酰胺(TCA)、MnSO4、温度、pH及培养基装量对发酵法生产利巴韦林的影响,确定了其摇瓶发酵工艺:培养至24h时添加10g/LTCA及10mg/LMnSO4,24h后每6h升温2℃,采用磷酸缓冲液调节pH,在500ml挡板三角瓶中培养基装液量为25ml。该工艺条件下经60h发酵,利巴韦林的摇瓶发酵水平达5.11g/L。

利用响应面法优化Bacillus subtilis SF4-3产3-羟基丁酮发酵培养基

利用Placket-Burman设计和响应面法对产3-羟基丁酮Bacillus subtilis SF4-3的发酵培养基进行优化,首先通过Placket-Burman设计筛选出影响较大的3个因素,分别为酵母膏、玉米浆和尿素,然后进行最陡爬坡实验逼近最佳响应面区域,最后根据Box-Benhnken的中心组合设计原理,进一步进行响应面分析实验,得到3因素的最佳浓度。在优化培养基下,3-羟基丁酮的产量达51.2g/L,比优化前提高了51%。

角蛋白酶产生菌的分离鉴定及其kerC的克隆表达

以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处土壤为样品,筛选出一株具有较强降解羽毛能力的细菌B-3菌株.经形态学、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为枯草芽孢杆菌B-3.并成功克隆到该菌株的角蛋白酶基因kerC(GenBank No.:JN021789),在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中获得了高效表达.该基因全长1146bp,GC含量46.5%,编码381个氨基酸,与已报道的枯草芽孢杆菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.:EU362730)同源性达到100%.重组菌株经IPTG诱导后角蛋白酶酶活力达14.8U/mL,经His-Tag纯化和SDS-PAGE分析表明,重组角蛋白酶分子量约为60kDa(融合了硫氧还蛋白,Trx).重组角蛋白酶最适反应温度和pH值分别为65℃与7.0.

内生枯草芽孢杆菌B9促生长效果及产吲哚乙酸(IAA)能力研究

【目的】内生枯草芽孢杆菌B9菌株是一株分离于甘蔗根部的内生枯草芽孢杆菌,探究其促生长作用及产吲哚乙酸(IAA)能力,为下一步将其研制成高效微生物肥料接种剂提供理论依据。【方法】以玉米种子、甘蔗单芽茎和甘蔗组培苗为供试材料,通过浸泡接种玉米种子与甘蔗单芽茎,明确B9的最适促生长密度,观察它们的生长势并测定芽长、根长、株高、生根数和根系重量;通过灌根接种甘蔗组培苗,观察试管组培苗中根系长势,测定盆栽组培苗根长、株高、根系活力、氮代谢相关酶活性、叶绿素以及光合指标,运用液质联用仪检测无菌上清液中与促生长相关的IAA的含量。【结果】B9菌液稀释后对玉米种子和幼苗均有一定的促生长作用,随着菌液稀释倍数的增加,促生长效果呈先增加后减弱的趋势,在1.0×10^6 CFU/mL时,对玉米生长情况的影响达到最佳。甘蔗单芽茎经1.0×10^6 CFU/mL的B9菌液处理后,其相关的形态和农艺性状均显著优于清水对照(P<0.05)。在该密度下,甘蔗组培苗的株高、根长、叶绿素含量、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和根系活力等指标均明显优于CK。在LB培养基B9菌液中,吲哚乙酸含量增加明显,在9 d时达到(95.63±2.33)ng/mL,比空白对照增加1054.9%。在Landy培养基菌液中,同样检测到吲哚乙酸呈不断增长的态势,在9 d时比对照高出2.56倍。【结论】B9菌株对甘蔗和玉米均具有明显的促生长效果,且发酵液中的IAA分泌能力强。

紫外UV-C与生防菌CF-3对采后荔枝贮藏品质的影响

以广西黑叶荔枝为试材,研究低温下紫外UV-C处理与生防菌CF-3对荔枝采后保鲜效果及生理的影响。实验结果表明:低温下,紫外UV-C复合生防菌CF-3处理可以显著抑制荔枝的霉褐变,尤其在贮藏期为21d时,好果率达84.44%,显著高于对照组。复合处理可以提高荔枝的感官品质,延缓荔枝营养物质Vc和TSS的消耗,抑制电导率、MDA含量的上升,POD、PPO活性的变化,减缓总酚含量和SOD活性的下降,延缓采后荔枝的成熟和衰老,较好地保持荔枝的风味和贮藏品质。

枯草芽孢杆菌Y-3生长特性及抗性研究

[目的]为枯草芽孢杆菌Y-3规模化发酵和降低成本提供理论依据。[方法]以分离的枯草芽孢杆菌Y-3为研究对象，对其生长特性、耐热性、耐酸、耐胆盐以及抗菌性进行研究。[结果]枯草芽孢杆菌Y．3培养14h生物活性量达到最高。初始pH6．3-8．0、培养温度30～37℃、装液量为20—100ml枯草芽孢杆菌Y-3均生长较好。枯草芽孢杆菌Y-3热力致死曲线线性方程为：y=-4．3365x＋435．58。分别在80、90℃热接触30s。存活率为97．45％和95．93％；在pH2—4酸性环境中作用3h后存活率超过73％；在猪胆盐浓度为0．5％以下的存活率超过80％。培养枯草芽孢杆菌Y-3产生抗菌活性效果的最佳条件为：初始pH7，温度25℃、装液量50ml，最佳试验条件下的抑菌圈为3．09cm。[结论]枯草芽孢杆菌Y-3能满足发酵饲料菌种要求。

重组枯草芽孢杆菌的构建及对甾体的C_(1，2)位脱氢

本文将简单节杆茵3-甾酮-1-脱氢酶基因克隆到分泌表达载体pWB980上,并转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到重组芽孢杆菌菌株。重组芽孢杆菌表达出的目的蛋白的分子量为55KDa,分光光度法检测到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0．5mU和15±0．6mU每毫克蛋白,对甾体底物4-AD的转化率为45．3%,比出发茵简单节杆菌提高了将近10倍。

应用内源前体策略提高杆菌发酵制备TTMP的能力

基于前体乙偶姻和四甲基吡嗪(TTMP)分子结构的相关性,建立了一种适合于风味化合物TTMP筛选的内源前体筛选策略;并应用该策略,从酱香型高温大曲中获得1株TTMP产生菌XZ1124,该菌株能利用葡萄糖代谢产生大量前体乙偶姻,从而有效促进了TTMP的合成;根据菌落、细胞形态特征和生理生化特性以及16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为枯草杆菌(Bacillus subtilis)。碳氮源以及培养条件的单因素优化结果表明,供氧条件和培养温度对TTMP合成的影响最为突出。在最优条件下,摇瓶发酵和发酵罐培养时前体乙偶姻的积累量>20 g/L,TTMP的合成量>4.08 g/L。上述结果有效证明了内源前体筛选策略用于筛选具有结构类似前体的风味功能菌;TTMP合成工艺具有生产强度高且能以廉价的农副产品(豆饼粉)作为底物,极具工业应用前景。

枯草杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基本酶学性质研究

β-葡聚糖是大麦淀粉质胚乳细胞壁的主要成份,约占大麦总重量的10％。β-葡聚糖酶（Endo-1,3-1,4-β-Glucanase）能专一性地分解大麦β-葡聚糖,产生可利用的还原糖。因此,是啤酒酿造业,农副产品加工业中一个亟待开发应用的重要工业用酶。本文报道了对枯草杆菌（B.SubtiliS 1.88）中分离制备的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基本酶学性质的研究结果。1

利用枯草芽孢杆菌发酵生产环磷腺苷的工业化试验

为了实现环磷腺苷的发酵生产,对一株枯草芽孢杆菌Bacillus.subtilis jsim-1277在摇瓶、自控罐、20 M3发酵罐上的发酵条件进行了试验。结果表明,最适宜发酵条件是p H 6.7,且添加K2HPO41.0 g/d L,Na F 0.05 g/d L;在摇瓶、自控罐、大型发酵罐产苷分别为7.17、6.01、7.10 g/L。

CTP-3和微波处理对食用菌栽培基质三种常见杂菌的灭菌效果研究

以食用菌栽培基质为试材,采用新型环保消毒剂CTP-3和微波方法,研究了100%、50%、25%、10%、5%、2.5%6种CTP-3浓度和30、60、90、120、150、180、210、240、270、300s10个微波作用时间对食用菌常用栽培基质中大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、木霉菌的灭菌效果,并选取其中最难以清除的菌体使用微波和消毒剂共同作用,观察杀菌效果。结果表明:消毒剂作用时,枯草芽孢杆菌在CTP-3 25%浓度下还有生长;大肠杆菌和木霉菌在消毒剂浓度为10%之后才有生长;而微波作用菌液时,大肠杆菌在微波240s后全部杀完,木霉菌在微波210s后全部杀完,而枯草芽孢杆菌在270s才全部杀灭,所以枯草芽孢杆菌是最难彻底清除的细菌;当消毒剂稀释10倍,并微波处理180s共同作用后可以完全杀菌。

枯草芽孢杆菌产3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇发酵条件优化

研究以一株从古井窖泥中分离筛选的枯草芽孢杆菌为出发菌株,进行发酵培养成分和发酵条件优化。与静置发酵相比,振荡培养可有效提高菌株发酵液中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的产量;在振荡培养的基础上采用正交试验方法对发酵培养基和培养条件进行了优化。实验结果表明,枯草芽孢杆菌发酵培养的最佳条件为:3mmol/L Mg^(2+),15g/L蛋白胨,150r/min,32℃。与初始静置发酵条件相比,最优条件下3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇(左旋)、2,3-丁二醇(内消旋)的产量分别提高了57.75%、1234.96%、163.33%。

一种用于枯草杆菌发酵生产四甲基吡嗪的补料策略

考察了铵盐对Bacillus subtilis CCTCC M 208157发酵产TTMP的影响,发现磷酸铵盐(DAP)对发酵体系中TTMP的合成有显著促进作用。进一步考察了TTMP合成对DAP的需求,结果表明,高浓度的DAP有利于TTMP的合成,但高浓度的铵根离子对细胞的生长和前体(3-羟基丁酮,乙偶姻)有抑制作用。基于以上结果,建立了一种铵盐A策略,并应用于摇瓶发酵和7.5-l发酵罐培养,TTMP浓度达7.46 g/L和7.34 g/L,与分批发酵相比分别提高了55.1%和29.0%。

枯草芽孢杆菌蛋白酶np基因在苏云金芽孢杆菌BMB171中的表达

为研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLYS_1蛋白酶np基因在苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)BMB171中的表达情况,从苏云金芽孢杆菌T6中克隆了cry3A启动子的两个片段,分别命名为pro3Aa和pro3Ab,并与pHT304质粒构建重组质粒pHT304-3Aa-np和pHT304-3Ab-np,分别转化苏云金芽孢杆菌BMB171,得到重组菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np。结果表明,重组菌BLYS-3Ab-np发酵液中约110 ku的蛋白酶条带亮度明显高于重组菌BLYS-3Aa-np发酵液中对应条带亮度,BLYS-3Ab-np产蛋白酶能力明显高于BLYS-3Aa-np,随着发酵时间延长到60 h,对应条带的亮度均比45 h条带弱,与发酵上清液中水解干酪素结果变化一致。

根际细菌LK2-3对黄瓜枯萎病的生物防治作用

LK2-3菌株是从番茄根系分离的植物根际生防细菌。为探讨生防细菌LK2-3对黄瓜枯萎病的生防潜力,采用皿内对峙试验和孢子萌发试验,测定LK2-3对黄瓜枯萎病菌的抑制活性;通过盆栽试验验证其对黄瓜枯萎病的防治效果,并根据形态特征、生理生化特性和16S rRNA序列同源性分析进行鉴定。结果表明,LK2-3菌株对黄瓜枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发均具有显著的抑制作用;在盆栽试验中,LK2-3处理显著促进黄瓜生长,并对黄瓜枯萎病具有明显的防治效果,其防治效果达到88.89%。同时,LK2-3在黄瓜根系和根际土壤具有良好的定殖能力。将LK2-3菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。综上所述,生防细菌LK2-3防治黄瓜枯萎病具有极大的潜力。

重组枯草芽孢杆菌全细胞催化合成钙二醇的初步研究

钙二醇(25-hydroxy vitamin D_(3),25-OH V_(D3))是一种具有广泛生理活性及药用价值的物质。该文旨在通过分子生物学手段构建1株异源表达V_(D3)羟化酶(V_(D3)hydroxylase,Vdh)的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600/pMA5-vdh,使其可以利用细胞催化系统合成25-OH V_(D3)。该重组菌株经诱导表达后,首先利用CO差光谱法评价Vdh的体外活性,并将其用作全细胞催化剂合成25-OH V_(D3),随后通过优化温度、时间、转速及pH等全细胞转化条件,提高其转化合成25-OH V_(D3)的产量。结果表明,37℃下培养24 h后,重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pMA5-vdh的菌体裂解物酶活力达0.56 nmol/g;并且在底物质量浓度为0.1 g/L、外加18 g/L葡萄糖和22.5 g/L的2-羟丙基-β-环糊精的条件下,控制初始pH为7、反应温度30℃、转速200 r/min时进行全细胞转化反应48 h,得到25-OH V_(D3)的转化率为10.36%,以上研究结果为制备和生产食品级25-OH V_(D3)提供了新的思路。

枯草芽孢杆菌产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵优化

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体,由于较低的热量和与蔗糖相似的甜度,D-阿洛酮糖成为一个具有发展前景的功能性甜味剂。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,EC 5.1.3.30,DPEase)能够催化D-果糖生产D-阿洛酮糖,这种生物酶法制备的功能性甜味剂D-阿洛酮糖由于简单的纯化步骤和高产物浓度等优点受到关注。该研究对1株前期构建的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal产DPEase进行了3 L发酵罐水平培养,通过优化溶解氧(DO)、pH、温度、初始碳源质量浓度确定最适发酵条件为:DO为30%、pH 6.0、温度37℃、初始葡萄糖质量浓度15 g/L,最高发酵酶活达78.3 U/mL。在此基础上进行补料发酵优化,得到最适补料条件为:在发酵5 h进行补料,碳源补料速率8.0 g/(L·h),在此条件下,发酵9 h全细胞酶活高达123.0 U/mL。此发酵策略为扩大工业化生产提供了参考。