冷却猪肉不同前处理对细菌DNA提取及PCR-DGGE的影响

比较研究冷却猪肉不同前处理对细菌DNA提取及PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)的影响。冷却猪肉4℃贮藏至第5天时,分别采用冻融、超声、摇床和匀浆前处理后,提取细菌DNA,进行Dilution-PCR和DGGE分析。结果表明,不同前处理方法所制备的DNA量稍有差别,但对PCR-DGGE结果无显著影响,故可根据实际情况选择上述不同前处理方法。同时对16S rDNA V3区的DGGE图谱进行割胶测序,检测到腐败菌主要是假单胞菌属,其他还有不动杆菌属、环丝菌属和沙雷氏菌属。

细菌DNA和gm-csf基因对抑制素基因免疫的作用

40只小鼠分为4组,分别注射pC ISI(抑制素质粒)、pC ISI+细菌DNA、pC ISI+pGM-CSF和生理盐水(8.5 g.L-1)。pC ISI剂量为20μg,与佐剂等量混合,2周后加强免疫1次。试验结果表明,细菌DNA佐剂组诱导77.8%(7/9)的个体产生了抑制素阳性抗体,抗体以IgG2α型为主,gm-csf佐剂组产生的抗体以IgG1型为主;基因佐剂联合抑制素基因免疫激发的淋巴细胞增殖能力显著高于抑制素基因单独免疫组(P<0.05);细菌DNA佐剂组阳性鼠的动情期血浆雌二醇高于阴性鼠(P<0.05),免疫对动情期孕酮水平无显著影响(P>0.05)。上述结果表明,细菌DNA和gm-csf能增强抑制素基因的免疫效果。

高效产氢新菌种的分离鉴定与16S rDNA全序列

为快速确定分离细菌的分类地位和获得高效产氢细菌,从生物制氢反应器活性污泥中,分离到一株高效产氢细菌.分离菌株能利用糖蜜废水生产氢气.分离菌株Rennanqilyfl的16S rDNA碱基为1517 bp,登记注册号为AY332397.为革兰氏阳性,杆菌,菌体端生2根鞭毛,鞭毛较长,无芽孢.菌株R1为中温嗜中性偏酸产氢菌,最佳生长代时为7.8 h.最佳生长温度为38℃;最佳生长pH为4.5;严格厌氧.单位体积产氢量(YH2)为1902.8 ml/L,每克干细胞最大产氢速率(QH2)为12.9 mmol/(g·h).该菌株的16S rDNA序列在GenBank中比较得出的最为接近的种分别来自Clostridium等5个菌属,其中与纤维素梭状菌亲缘关系最近,16S rDNA同源性为91%,其他则为89%-90%.新分离菌株Rennanqilyfl是一个与其最近的梭状菌属各成员都不相同的新种,暂命名为生物制氢菌属Biohydrogenbacterium Gen.Nov.Sp.Nov.

2种改进的未知细菌DNA提取方法

[目的]研究细菌DNA的提取方法，为未知细菌的研究提供方法支持。[方法]从DNA的纯度、基因组DNA的酶切效果、16SrRNA基因扩增等方面比较了细菌DNA的2种提取方法。[结果]方法Ⅰ提取的DNA的纯度（OD260／OD280）为1．51-1．65，6个样品的平均值为1．56。方法Ⅱ提取的DNA的纯度（0D260／OD280）为1．25～1．41，6个样品的平均值为1．33。方法隈取的DNA纯度较高，但其试验步骤稍微繁琐。方法Ⅱ的试验步骤稍微简单，但试验时间较长。2种方法均提取到长度大于21kb）的细菌基因组DNA。对2种方法提取的DNA进行PCR扩增都得到长度约600bp的条带，效果较好。[结论]2种方法提取的DNA质量均较高，都可以直接用于RFLP、PCR等研究。

大鼠肠内容物细菌基因组DNA提取方法的比较

目的比较两种肠内容物前处理和两种提取方法对清洁级SD大鼠肠内容物细菌基因组DNA提取效率。方法分别选用PBS多次离心漂洗、液氮破细胞两种前处理方法和酚/氯仿抽提、试剂盒过柱法两种提取方法进行组合分析,对4份肠内容物和16份含金黄色葡萄球菌肠内容物进行随机提取。结果大鼠肠内容物细菌基因组DNA含量和纯度测定结果显示,与PBS反复离心相比,液氮研磨前处理能显著提高大鼠肠内容物基因组DNA。荧光定量PCR表明,液氮研磨前处理较PBS反复离心能更好地收集细菌基因组DNA,其Ct值最低。结论研究结果表明,采用液氮研磨试剂盒法在大鼠肠内容物DNA提取中是较为优良的方法,该方法为建立实验动物中微生物的定量PCR检测方法打下了基础。

细菌染色体DNA G+C mol%含量测定方法研究进展

生物体的遗传物质DNA中四种碱基G、C、A、T的排列和比例是DNA特性的决定因素。染色体DNAG+Cmol%含量即DNA的碱基组成具有种特异性且不受菌龄和外界因素的影响,成为细菌分类和菌种鉴定的重要指标,其测定方法不断被改进和创新,主要包括纸层析法、浮力密度法、高效液相色谱法、热变性温度测定法(Tm法)和荧光法等,其中Tm法操作简便、精确度高、重复性好,最为常用,此法在国外早已发展,在国内也引起越来越多的重视,此法利用DNA的增色效应求Tm值(热变性温度),G+Cmol%含量与Tm值呈正比例关系。简略比较了测定细菌染色体DNAG+Cmol%含量的五种主要方法,具体介绍了Tm法测定细菌染色体DNAG+Cmol%含量的原理、测定程序、操作注意事项、G+Cmol%含量测定的意义和应用局限性及G+Cmol%含量测定方法的前景展望。

结直肠癌患者粪便细菌DNA提取方法的比较研究

目的比较结直肠癌患者粪便细菌DNA提取方法的优缺点及获得DNA的质与量,有利于结直肠癌患者肠道相关分子微生态的研究。方法采用传统法,化学裂解法和TIA Namp bacteria DNA Kit试剂盒法,提取粪便中细菌DNA,比较其作为模板,用于细菌16S rRNA基因PCR扩增后凝胶电泳的优缺点及用核酸蛋白检测仪Biophotmeter测定提取DNA的质与量。结果传统法提取DNA的量及纯度均较低(22.37±2.45,3.24±0.22),化学裂解法和试剂盒方法提取的量及纯度均较高,(分别为33.87±2.06,2.18±0.44;38.60±9.00,1.70±0.09);传统法与化学裂解法、试剂盒法相比差异有统计学意义(P<0.05),化学裂解法与试剂盒法相比差异无统计学意义(P>0.05),但以试剂盒法为佳。结论3种方法各具优缺点,不同的DNA提取方法会影响结直肠癌患者肠道相关分子微生态的研究结果。与传统法和化学裂解法比较,试剂盒提取法的效率更高,能够检测到更多种类的细菌,更合适肠道相关分子微生态的研究。

联检TB-DNA、LAM-IgG和ADA诊断小儿结核性脑膜炎

目的评价联检脑脊液结核杆菌DNA(TB-DNA)、抗阿拉伯糖甘露糖脂IgG抗体(LAM-IgG)和腺苷脱氨酶(ADA)指标诊断小儿结核性脑膜炎(结脑)及评价病情的价值。方法结脑组67例、非结核组38例,脑脊液标本应用聚合酶链反应法检测AFB、斑点免疫金渗滤试验法检测LAM-IgG、酶动力学终点法检测ADA。结果TB-DNA+LAM-IgG诊断结脑的特异性为100%、阳性率为86.1%。结脑病情进展,ADA呈升高趋势;病情好转,ADA呈下降趋势。结论在诊断结脑方面,TB-DNA+LAM-IgG联合试验的应用价值明显高于经典方法;在动态了解病情方面,ADA有较高的应用价值。三者联合应用可提高对小儿结脑诊断和评价的价值。

DNA标记技术在乳酸菌分类鉴定中的应用

通过DNA标记技术研究乳酸菌的基因型特征,阐明它们与类似属种在系统发育上的亲缘关系成为乳酸菌分类和鉴定的研究热点。综述了DNA标记技术在乳酸菌分类鉴定中的研究进展。

镧和铈对两种细菌生长的影响及胞内DNA的荧光光谱分析

为了研究镧,铈对细菌生长及核酸的影响,用光电比浊法测定了镧,铈和钙调蛋白抑制剂(氯丙嗪)存在时两种细菌的生长曲线,并用荧光光谱法研究了镧,铈对小牛胸腺DNA和细菌胞内DNA结构的影响。结果显示适当浓度(200mg.L-1)稀土元素可以促进细菌的生长和繁殖,比对照提前进入对数期,扫描电镜观察也显示镧,铈可以促进枯草芽孢杆菌个体的生长,菌体体积比对照更大,但促进繁殖的作用会被氯丙嗪抑制,表明镧,铈促进细菌生长的机理可能与钙调蛋白的功能有关;荧光光谱分析显示镧,铈会使小牛胸腺DNA荧光增强,镧、铈浓度分别为5和10mg.L-1时荧光增强作用最大;但镧使细菌胞内DNA荧光猝灭,铈使其荧光增强,结论认为镧,铈对核酸的影响远比想象的要复杂。

光合细菌改善Cd、Pb及呋喃丹污染土壤的微生物群落DNA序列多样性的研究

应用DNA随机扩增多态性(RAPD)分子标记技术研究了光合细菌(PSB)对Cd、Pb及呋喃丹污染土壤的微生物群落DNA序列多样性的影响。结果表明,Cd、Pb及呋喃丹单一污染或3者复合污染土壤的微生物群落DNA序列的丰富度相对对照土样(S0)都有不同程度的增加,受Cd、Pb或呋喃丹污染,可能会引起土壤微生物群落DNA序列本身发生变化;S0与加入PSB的土样(Cd、Pb及呋喃丹单一污染土样或3者复合污染土样)微生物群落间的DNA序列的相似系数要高于S0与不加PSB的土样(Cd、Pb及呋喃丹单一污染土样或3者复合污染土样)微生物群落间的DNA序列,PSB对改善土壤微生物群落DNA序列的组成有积极的影响。

一种通用的从少量培养液中快速提取细菌染色体DNA的方法

目的 建立一种通用、快速、简便的提取细菌染色体DNA的方法。方法 用丙酮破坏细菌细胞壁膜脂质结构 ,裂解液破除细菌细胞膜 ,释放胞内核酸 ,经酚 /氯仿 /异戊醇去除蛋白质及多糖 ,无水乙醇沉淀DNA ,TE缓冲液溶解DNA。结果 提取染色体DNA的琼脂糖电泳图谱 ,对于G 杆菌与经典的CTAB法提取的DNA图谱相同 ,对于G +球菌其效果要明显好于CTAB法。所得DNA能被HindⅢ酶切消化 ,能用于RAPD扩增。结论 这种提取染色体DNA的新方法 ,对于所收集的 8种不同的细菌都有较好的结果 ,是一种通用的细菌染色体DNA提取方法。

DNA分子标记技术在乳酸菌多态性研究中的应用

本文概述了常用于乳酸菌分离鉴定及多态性研究中的基于rDNA序列的分子标记技术和几种DNA指纹图谱技术(RAPD,ARDRA,AFLP,REP/ERIC-PCR),并对这些技术的原理、方法及其近几年在乳酸菌研究中的进展进行了介绍。同时本文还比较了各种方法的优缺点,不同的研究方法,其分辨率和检测限不同,必须根据研究目的,选择合适的分析方法。

利用肠道菌群的分布和16S DNA序列研究鲤科肠道菌系统演化关系

肠道微生物与寄主具有复杂的、多方面的相互依存效应,这种依存效应所产生的共生关系或协同进化关系既可反映寄主间的系统演化关系,也可显示肠道微生物间的系统演化关系,共生关系或协同进化关系是由于寄主与肠道微生物两者之间存在着相互自然选择作用所形成的,在长期的进化历程中逐步发生的共生关系信息很可能被记录在DNA序列中。本文通过检测鲤鱼科8种鱼中9种肠道菌群的分布含量对这9种菌群进行分析,且利用从 GenBank调取这 9种肠道细菌菌属的 43个种或亚种的 165 DNA序列的构建 NJ树和 MP树,将这 6个科 9个属43个种或亚种分为革兰氏阴性和革兰氏阳性两大类群（一级分枝）。在这两类群中,又以科为单位分为6个亚类群（二级分枝）,而肠杆菌科中则以属为单位分为4个小类群（三级分枝）,此外球状菌与杆状菌也能截然分开。将 165 DNA的 NJ树隐去所有的种,以属为单位所得到的以分枝形式的无根树在拓扑结构上与菌群分布含量（寄主范围）所构建的无根树相近,但芽抱杆菌在两种无根树的位置中有较大的差异。如果提高检测水平,扩大所检测的寄主对象,这种差异有可能消除。

几株光合细菌的表型特征及DNA－NDA同源性分析

对５株新分离的光合细菌从形态、生理生化及ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性等方面进行了研究．结果表明，菌株８与深红红螺菌（Ｐｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ）的模式菌株ＡＴＣＣ１１１７０的ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性为９７％，菌株３７与沼泽红假单胞菌（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ）的模式菌株ＡＴＣＣ１７００１的ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性为８０％；菌株５５与球形红杆菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）的模式菌株ＡＴＣＣ１７０２３的ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性为７１％；菌株４０和５２分别为另外两个ＤＮＡ同源群．根据各菌株形态、生理生化等表型特征以及ＤＮＡＧ＋Ｃｍｏｌ％和ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性分析结果，确定了几株光合细菌的分类地位．

采用新的DNA进化算法自动设计Takagi-Sugeno模糊控制器(英文)

提出一种新颖的基于ＤＮＡ的进化算法（ＤＮＡ－ＥＡ）来自动设计一类Ｔａｋａｇｉ Ｓｕｇｅｎｏ（ＴＳ）模糊控制器．ＴＳ模糊控制器采用带有线性规则后项的ＴＳ模糊规则，连续输 入模糊集，Ｚａｄｅｈ模糊逻辑和常用的重心反模糊器．ＴＳ模糊控制器被证明是带有可变增 益的非线性ＰＩ控制器．ＤＮＡ－ＥＡ被用于自动获取ＴＳ模糊规则，并同时优化模糊规则前 项和后项中的设计参数．ＤＮＡ－ＥＡ采用由生物ＤＮＡ结构启发得到的ＤＮＡ编码方法来编 码模糊控制器的设计参数．在ＤＮＡ－ＥＡ中，引入了受微生物进化现象启发的基因转移和细 菌变异操作．另外，也引入了基于 ＤＮＡ遗传操作的框构变异操作． ＤＮＡ编码方法非常适 合于复杂知识的表达，基于基因水平的遗传操作也很容易引入到ＤＮＡ－ＥＡ中．染色体的长 度是可变的，且可插入或删除部分碱基序列。作为示例，给出了采用ＤＮＡ－ＥＡ来自动设计 ＴＳ模糊控制器用于控制一类非线性系统的方法．ＤＮＡ－ＥＡ能自动地构造模糊控制器．计 算机仿真结果表明，ＤＮＡ－ＥＡ是有效的，且优化得到的模糊控制器是满意的．

随机扩增多态性DNA在细菌鉴定分型中的影响因素

为探讨各种试剂的浓度及不同DNA扩增仪对随机扩增多态性DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA ;RAPD)的影响因素。用不同浓度引物、4×dNTP等试剂及 3种不同型号DNA扩增仪对 11株致病弧菌进行RAPD扩增。结果 11株致病弧菌分成 4型 ,重复性好。不同引物、4×dNTP对RAPD构成一定影响 ,3种DNA扩增仪产生的DNA指纹图谱基本一致。提示用于RAPD的试剂可以标准化 。

肠癌患者与健康人群肠道菌群基因组DNA鉴定与特征

目的探讨肠道肿瘤患者与健康人群肠道菌群构成及基因组DNA的变化特征.方法分别采集肠癌患者与健康人晨起粪便,进行需氧和厌氧培养,鉴定菌株并进行菌落计数.采用试剂盒法提取粪便中肠道细菌总基因组DNA,进行琼脂糖凝胶电泳.结果肠癌组与健康对照组比较,肠杆菌数量增多,以大肠埃希菌数量显著,乳酸杆菌和双歧杆菌明显减少,厌氧菌和需氧菌的数量比例颠倒,两组数据比较差异均具有统计学意义(P<0.05).粪便总基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳在23 130 bp处有清晰、明亮的单一条带,且肠癌组与健康对照组均有相同大小的条带.结论肠癌组与健康对照组肠道菌群组成存在差异,肠道菌群总基因组DNA没有变化.

一株野生细菌的16Sr DNA序列分析与系统发育树的构建

以野生细菌F0 30 3的总DNA为模板 ,采用细菌 16SrDNA的通用引物 ,通过PCR的方法扩增到一条约 1.5Kb的 16SrDNA片段。连接到pGEM -T -easy克隆载体上 ,并用化学法转化E .coliDH5α。用EcoRI对 5个随机挑取的转化子进行的酶切分析表明这 5个转化子皆为阳性。DNA测序表明该PCR扩增到的 16SrDNA片段长为 14 75核苷酸。与GenBank上已提交的16SrDNA进行的比对 (BLAST)表明野生细菌F0 30 3归属于沙雷氏属。由VectorNTISuite 6软件构建的系统发育树表明与深红色沙雷氏细菌 (Serratiarubidaea)亲源关系最近 ,在核苷酸水平有 97.8%的相似性。

粪便标本中细菌DNA提取方法的比较

目的比较粪便标本中细菌DNA三种提取方法的优缺点。方法采用传统法,溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)提取法和试剂盒法提取粪便标本中细菌DNA,比较其作为模板用于PCR扩增细菌16SrDNA的优缺点。结果三种方法制备的细菌DNA均能成功用作后续PCR扩增的模板。传统法经济可靠,但提取的DNA量及纯度均较低。利用CTAB法进行提取可有效去除粪便中的色素和多糖成分,但操作要求较高,难以标准化。试剂盒法提取方便,操作简单,质量稳定,易标准化,且价格适中,是临床值得推荐的提取方法。结论三种方法各具优缺点,应根据实验室条件和实验要求进行选择。