ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。

重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达

【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β(PDGFRβ)链膜外区与人IgGFc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFastbac-sPDGFRβ/Fc,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,使目的基因与杆状病毒基因组DNA发生位点特异性重组,获得重组病毒DNA,将其通过脂质体转染昆虫细胞Sf9获得重组病毒。将该重组病毒感染Sf9无血清细胞系,在Sf9细胞中表达sPDGFRβ/Fc,对表达产物进行Western blotting检测和Protein A亲合层析纯化,并进一步通过MTT法检测获得的重组蛋白生物学活性。【结果】重组病毒感染Sf9细胞后,经Western blotting分析,能检测到一条分子量约为97kDa的特异性条带,与目的蛋白大小相符。通过ProteinA亲和层析,获得了纯度达75%以上,表达量为1μg/mL细胞培养上清的重组融合蛋白,MTT结果显示该重组融合蛋白sPDGFRβ/Fc具有抑制PDGF刺激的Balb/c3T3细胞增殖的能力。【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc可在昆虫细胞中成功地得到表达。

家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白及生物活性的研究

人表皮生长因子（hEGF），一种由53个氨基酸残基组成的单链多肽，具有广阔的应用前景。本文主要探讨家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白的生物活性。采用家蚕杆状病毒表达系统来表达该信号肽融合蛋白。构建了重组质粒pBacPAKS—hEGF，将该重组质粒与线性化病毒Bm．BacPAK6DNA共转染家蚕细胞，筛选获得重组病毒vBacPAK—sEGR用vBacPAK—sEGF感染家蚕BmN细胞和五龄蚕，Westernblot检测表明在家蚕细胞、五岭幼虫的血淋巴和蛹中均有约12kD的目的蛋白表达。ELISA检测发现在家蚕细胞中的表达量为23gg／100细胞，五龄幼虫中的表达量可达到82μg／mL血淋巴。利用小鼠成纤维细胞Balb／c3T3分析家蚕表达的hEGF信号肽融合蛋白的生物活性．结果表明表达产物能显著促进Balb／c3T3细胞的增值。另外，研究还发现hEGF信号肽融合蛋白可使新生ICR小鼠体重增加，睁眼和萌齿时间提前。本研究为进一步开发利用家蚕表达的hEGF提供理论基础。

杆状病毒蛋白表达系统制备可溶性LRIG1蛋白及其鉴定

目的为进一步研究肿瘤的治疗提供高质量的可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白(sLRIG1)。方法用重组sLRIG1的杆状病毒(Bac-sLRIG1)感染sf9昆虫细胞,表达的蛋白经提纯,获得sLRIG1蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹进行分析鉴定。结果使用杆状病毒表达载体系统(BEVS)成功表达了重组sLRIG1蛋白,最佳感染复率为5,孵育时间为72 h,经鉴定蛋白表达正确,纯度高达95%。结论用BEVS可成功获得大量高纯度重组sLRIG1蛋白,可满足后续实验的需要。

应当引起关注的昆虫细胞中的弹状病毒污染

Sf弹状病毒(Sf-rhabdovirus,Sf-RV)是2014年从雌性草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,Sf)蛹中分离得到的昆虫细胞系(Sf)中发现的一种弹状病毒,为线性负义单链RNA病毒。在Sf细胞系中发现的新弹状病毒(Sf-RV)使人们对昆虫细胞杆状病毒表达载体系统(Insect cell baculovirus expression vector system,IC-BEVS)生产的生物制剂的安全性表示质疑。本文主要对该病毒基因组构成、组成蛋白功能、感染宿主细胞能力宿主细胞对病毒的影响以及病毒带来的潜在安全性问题等方面进行简要阐述,以增加人们的认识。