水稻香味基因Badh2的功能和效应分析

香稻是一种具有芳香气味的特种稻资源,具有较高的营养价值和经济价值。通过克隆香味基因Badh2启动子区插入序列badh2-p,构建启动子区插入突变表达载体pCAMBIA 1300-badh2-pi,转化水稻品种C5。采用qRT-PCR分析Badh2基因的表达量,同时利用GC-IMS联用技术测定香味物质2-AP和其他挥发性有机物的含量。结果表明:转基因株系叶片中Badh2基因的表达水平都升高了,其中有2株的Badh2基因表达水平极显著升高;转基因株系叶片中大部分挥发性化合物的含量高于野生型C5,2-AP浓度与Badh2基因的相对表达量水平成正相关。

水稻香味基因Badh2的功能和效应分析

香稻是一种具有芳香气味的特种稻资源,具有较高的营养价值和经济价值。通过克隆香味基因Badh2启动子区插入序列badh2-p,构建启动子区插入突变表达载体p CAMBIA 1300-badh2-pi,转化水稻品种C5。采用q RT-PCR分析Badh2基因的表达量,同时利用GC-IMS联用技术测定香味物质2-AP和其他挥发性有机物的含量。结果表明:转基因株系叶片中Badh2基因的表达水平都升高了,其中有2株的Badh2基因表达水平极显著升高;转基因株系叶片中大部分挥发性化合物的含量高于野生型C5,2-AP浓度与Badh2基因的相对表达量水平成正相关。

豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用

【目的】香稻中香味的产生是由于水稻第8染色体上面Badh2基因的功能缺失而导致2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)前体物质的增多,进而2AP积累使稻米产生香气。【方法】本研究利用Badh2基因开发的7个功能标记,针对豫南地区16份香稻品种进行了检测与分析。【结果】4份香稻品种属于第2外显子突变类型,2份香稻品种属于第4~5外显子突变类型,5份香稻品种属于第7外显子突变类型;并没有发现Badh2基因启动子区及第12~14外显子突变类型的香稻品种。【结论】通过Badh2基因功能标记的检测与分析,本研究鉴定了豫南香稻品种对应的突变类型,为利用分子标记辅助选择培育优质香稻新品种奠定基础。

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295μg·g-1,极显著(P<0.01)高于非转基因对照(0.046μg·g-1)。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。

番茄BADH2基因转化水稻

用分子生物学手段,构建含番茄BADH2基因的过表达载体,通过农杆菌介导的方法将其导入日本晴幼胚诱导的愈伤组织,获得了303块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织。获得1 059个转化植株。随机选择115个T0植株进行Hyp离体叶片筛选,结果表明,绝大多数植株均呈抗性,并且与PCR检测结果相吻合,说明T0植株中不存在假阳性。

基于基因组测序揭示香稻Badh2基因的变异信息

香稻是一种具有芳香气味的特种稻资源,具有较高的营养价值和经济价值。利用二代测序技术对3个香稻品种XW13、YZX及XW17进行全基因组测序,发现3个香稻品种的Badh2基因序列一致,在编码区无明显变异的情况下,启动子区有1个8 bp的插入突变,这种变异类型在已测序并公开发表的76份香稻资源的Badh2基因序列中也有发现,命名为badh2-p。

广西特色香稻地方品种香味及其香味基因型的鉴定

【目的】鉴定广西地方香稻品种的香味及其香味基因型,为开发和利用广西香稻地方种质资源及选育优质特色香稻品种提供理论依据。【方法】将传统香味鉴定方法(KOH浸泡法和籽粒咀嚼法)与分子标记技术结合,对179份广西地方香稻种质资源的香味及其香味基因型进行鉴定。【结果】179份供试材料中,KOH浸泡法检测到具有香味的材料167份,籽粒咀嚼法检测到具有香味的材料124份。籽粒咀嚼法鉴定为香稻的品种中97.58%能用KOH浸泡法鉴定出香味,但KOH浸泡法鉴定为香稻的品种中仅72.46%能用籽粒咀嚼法鉴定出香味。利用分子标记法能检测到等位基因的有71份,占供试材料总数的39.66%,主要以InDel7和InDel4-5等位基因为主,其中仅1份检测到InDel2等位基因,40份检测到InDel7等位基因,37份检测到InDel4-5等位基因,未检测到InDel13等位基因,但有7份同时检测到InDel7等位基因和InDel4-5等位基因。71份能检测到等位基因的材料中有69份被籽粒咀嚼法和/或KOH浸泡法鉴定为香稻品种,正确率达97.18%。在籽粒咀嚼法和KOH浸泡法均鉴定为香稻的121个品种中,香味表型明确,但仅有55个品种能检测到等位基因,检出率为45.45%。来自百色市的供试材料中能检测到等位基因的品种占该市香稻品种总数的53.19%,含有InDel2、InDel7和InDel4-5等位基因型,但以Indel7等位基因型为主;来自河池市的供试材料中能检测到等位基因品种占该市香稻品种总数的比例最高,达64.10%,但只检测到2种基因型,以Indel4-5等位基因型为主;柳州市及其他市能检测到等位基因的比例远低于百色市和河池市。【结论】广西香稻地方品种具有较强的地域特色,不同地区的香稻香味等位基因存在明显差异,且可能存在已报道的等位基因之外的香味基因或香味等位基因,仅用4个已报道的等位基因不足以检测出全部的香稻品种,应将分子标记法与传统鉴定方法相结合,才可更准确鉴定出香稻品种。

不同来源特种稻香味和黑色种皮基因的鉴定与遗传特性分析

特种稻是一类具有特殊遗传性状和用途的水稻品种,目前已成为杂交水稻育种的一个重要方向,选择和利用不同来源特种稻种质资源并对其特殊性状基因型进行鉴定和遗传特性分析,对进一步促进特种稻的遗传改良及新品种的选育具有重要意义。本研究利用特异性分子标记InDel-E2、FMbadh2-E7、CAPSRa和CAPS-Ra以及自主开发设计的特异性功能标记FMbadh2-E2、FMbadh2-E7A、FMbadh2-E7B、Ra-CAPS1和Ra-CAPS2并结合基因克隆和测序技术对来自不同地区的32份优质香型水稻亲本材料的香味基因和8份黑米水稻品种的黑色种皮基因进行了基因型鉴定和分析。研究发现,在32份香型水稻材料中,有28份香味性状来源于水稻第8号染色体上编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2的功能缺失突变,且为常见的badh2-E7等位突变类型,其在Badh2基因第7外显子处发生8 bp缺失和3个单核苷酸(SNPs)位点多态性突变;2份(板仓香糯和八桂香)表现为香味基因杂合型(Badh2/badh2);2份(溪香和莉香占)在Badh2基因第2和第7外显子处均未发生碱基缺失突变,且具有完整的Badh2基因位点编码序列,其香味性状可能不受Badh2等位基因控制。另外,研究发现,8份黑米水稻品种的黑色种皮均由位于水稻第4号染色体上的Ra/Pb基因控制,其在第7外显子处均表现为2 bp(GT)的缺失突变。同时本研究通过构建多个杂交F2群体对Badh2和Ra基因进行了遗传特性分析,发现其香味和黑色种皮性状分别受1对细胞核隐性和1对细胞核显性主效基因控制。本研究通过对不同来源优质香型水稻亲本材料的香味基因和黑米水稻品种的黑色种皮基因进行鉴定、特异性功能分子标记的开发以及遗传特性分析,为进一步通过分子标记辅助选择育种技术,选育优质、高产且具有香味的杂交水稻新品种及黑米品种提供了重要的理论基础,可明显提高特种稻的选育效率,同时对进一步发现和挖掘新的香味控制基因及黑色种皮基因的研究具有重要意义。

利用CRISPR/Cas9技术创制香稻

【目的】随着人们生活水平的不断提高,具有香味的优质稻米日渐受到消费者的欢迎。水稻的香味性状主要受第8染色体上的BADH2基因控制,该基因突变造成稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉的积累而产生香味,加速香稻培育的进程。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以适宜江西种植的粳稻台南11为研究材料,在BADH2基因的第3外显子处设计靶位点创制BADH2基因突变株系,利用潮霉素抗性标记筛选获得阳性转基因植株,经测序和PCR分析获得无转基因成分的稳定突变株系。利用气相色谱质谱联用仪测定野生型和T3代突变体材料中2-乙酰-1-吡咯啉的含量。考查分析野生型和T3代突变体材料的产量及品质。【结果】成功获得了BADH2基因突变株系,对这些株系进行鉴定分析,获得4种突变类型,其中插入突变1种,缺失突变3种;突变体材料中的2-乙酰-1-吡咯啉较野生型含量均显著提高;与野生型相比,突变体材料中的有效分蘖数、每穗总粒数、结实率等产量性状呈现显著性差异,产量平均减少8.7%;突变体材料中的蛋白质含量、整精米率、垩白度、长宽比等品质相关性状与野生型相比呈现显著性差异,品质在一定程度上有所提高。【结论】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功对水稻中的BADH2基因进行了敲除,显著提高了水稻中香味物质的积累,缩短了培育香稻的时间,为进一步选育香稻提供理论技术和材料支撑。

四引物扩增受阻突变体系PCR检测水稻香味基因badh2方法的优化

badh2是控制水稻香味的主效基因,其与等位非香基因Badh2功能差异主要在于第七外显子上的8 bp缺失及3个SNP,开发其易于分辨且稳定的功能标记将有助于香稻分子育种。本研究基于四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra Primer Amplification Refractory Mutation System PCR,Tetra-primer ARMS PCR)原理,在功能差异位点外侧两引物一致的情况下,分别设计与badh2和Badh2完全匹配的5'端添加错配碱基的靶引物。结果表明,经1%的琼脂糖凝胶电泳后,由完全匹配引物组成的PCR体系基本能分辨badh2/Badh2基因型,但目标条带较模糊;而引物中5'端引入错配碱基的PCR体系能产生更明晰、易于分辨的目标条带。本研究将有助于香稻分子育种及为其他类似分子标记的优化提供借鉴。

不同来源水稻种质资源香味基因badh2位点的鉴定

发掘和利用香稻基因资源是开展优质香稻品质改良的首要条件。本研究利用水稻香味功能基因分子标记,结合传统的味觉和嗅觉鉴定法,分析了不同来源不同类型的323份水稻种质的香味性状。研究结果表明:利用分子标记技术和谷粒咀嚼品尝是快速、准确鉴定水稻香味性状的优选策略;香味基因badh2位点频率在印度尼西亚和泰国的籼稻中达到68.2%以上,在美国、俄罗斯和意大利的粳稻中较低,在云南、缅甸、老挝和尼泊尔的普通野生稻中没发现;在发现的具香味性状的86份种质中,极大部分种质的香味性状受badh2等位基因控制,但有6份的香味性状可能不受badh2等位基因控制。这些香稻基因资源将是下一步开展稻米香味遗传分析以及香米品种改良的重要基础。

两种筛选水稻badh2-E2类型香味基因分子标记的建立

本研究根据香味基因(badh2-E2)与非香基因(Badh2)在第2外显子7个脱氧核苷酸序列缺失差异,建立了一个新的STS分子标记和检测方法;并根据badh2-E2与Badh2+310 bp位点脱氧核苷酸的差异性,建立一个新的CAPS(EheⅠ)分子标记和检测方法。结果显示:建立的STS分子标记与前人的报道相比扩增的条带更小,只有100 bp左右,能够更加清晰地鉴别出香与非香基因型之间的差异;而建立的CAPS(EheⅠ)分子标记,纯合非香稻可获得长度为292 bp和375 bp两条带,纯合香稻可获得长度为667 bp一条带,杂合F1植株可获得长度为292 bp、375 bp和667 bp3条带,对于不同基因型检测结果的判断效果更明显。采用本研究建立的方法能够提高水稻badh2-E2类型香味基因选择效率。

27种香稻品种badh2突变位点序列的分析

水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因(Badh2)第7外显子和第2外显子的突变是导致稻米变香的主要原因。本研究分别对包含第7外显子或第2外显子的PCR产物进行测序分析,以明确27种适宜海南省种植的香稻品种的Badh2的突变序列。研究结果表明:海香5701、山栏香糯、海香6309等20个品种Badh2基因的突变类型为第7外显子发生了8 bp的缺失和3个碱基的突变,所有27个水稻香稻品种第2外显子序列都未发生改变。本研究结果可为这些香稻品种的保护与鉴定、及作为香味基因供体改良其他优良品种奠定基础。

基于PCR/LDR技术的水稻香味等位基因Badh2-E2功能性分子标记

水稻中水稻甜菜碱醛脱氢酶(BADH2)功能缺失导致其酶促反应的底物2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)的累积,使得稻米产生香味。水稻香味等位基因badh2-E2在中国的香稻育种中有较广泛的应用。本研究根据badh2-E2香味等位基因在第二外显子处7 bp缺失,设计了一个基于PCR/LDR技术的功能性分子标记。利用PCR/LDR标记对‘申繁24’、‘申恢26’,及其杂交F1代的基因型进行鉴定,可以准确地鉴定出badh2-E2位点的基因型。用PCR/LDR标记对杂交F2代群体的基因型进行鉴定,发现badh2-E2阳性纯合型、杂合型和badh2-E2阴性纯合型这3种基因型符合1∶2∶1分离比。本研究结果为标记辅助育种提供了一种新的标记类型,具有一定的应用价值。

标记辅助选择结合花药培养创制优异香型粳稻种质

香米是较受市场青睐的稻米类型,在优质香稻品种中,‘稻花香2号’久负盛名,但其产量较低、稻瘟病抗性较弱;因此,通过对‘稻花香2号’的遗传改良,育成高产、高抗稻瘟病类型的香型种质意义重大。本研究以‘稻花香2号’为香型badh2基因的供体亲本,以携带稻瘟病抗性基因Pita、Pib及Pid2的粳稻种质‘盐粳144’为背景亲本,开展了优异香型种质培育工作。利用标记辅助选择结合花药培养技术,于3年内,成功创制同时聚合badh2、Pita、Pib及Pid2基因的改良系4份;香味、稻瘟病抗性及产量和品质鉴定表明,4份改良系的2-AP含量均接近‘稻花香2号’水平,而稻瘟病抗性和产量显著优于‘稻花香2号’,但食味品质相比于‘稻花香2号’仍存在差距。最终,获得一份产量、抗性及品质综合性状较优的改良系-3,参加辽宁省优质食味组区域试验。上述结果为多基因聚合育种及优质香型稻培育提供了技术支撑及优异种质。

24种香稻品种甜菜碱醛脱氢酶2基因突变位点的分析及分子标记开发

根据香型与非香型水稻甜菜碱醛脱氢酶2基因(badh2)在第2、第4内含子、第7外显子3处序列差异和第2外显子1处序列差异,分别设计了两类检测badh2第7和第2外显子突变的功能性分子标记引物M7和M2;利用两类引物,分别对属于第7外显子突变的香型水稻W香99075和第2外显子突变的香型水稻武香14、非香型水稻以及两种香稻分别与非香稻杂交的F1植株基因组DNA进行PCR检测后发现,M7和M2引物完全能够分别被用于以第7和第2外显子突变的香稻作为亲本,进行分子标记辅助培育香稻新品种的研究。M7引物综合考虑了badh2内含子和外显子两方面突变情况而设计的。以非香稻261S、分别发生第7和第2外显子突变的香稻品种W香99075和武香14为对照,使用M7和M2引物,对本实验室收集的另外22份香稻品种进行badh2突变位点检测,结果可将这些香稻分为badh2第2外显子突变类型、第7外显子突变类型和外显子未发生突变类型,同时明确了大多目前在上海等周边地区种植的香稻品种的badh2所属的突变位点。开展本研究为利用分子标记辅助选育香型水稻新品种研究奠定了重要的基础。

贵州省优质水稻‘大粒香’香味基因分子标记的开发

‘大粒香’香味形成是由Badh2基因第7个外显子的8 bp缺失和3 bp突变引起。为了建立了‘大粒香’香味基因的快速准确的检测方法,本研究根据‘大粒香’和‘日本晴’Badh2基因序列的差异,设计了7条引物组合成11对功能标记检测引物,通过对引物组合扩增的产物进行电泳检测,筛选出最佳的引物组合。试验结果表明,开发设计的引物能够准确的检测出香味基因,PCR反应的最佳退火温度为60℃,其中BADH2-F1+BADH2-R+badh2-R2引物组合能准确区分非香基因纯合体、香味基因纯合体以及杂合体三种基因型。基于该功能引物引物组合BADH2-F1+BADH2-R+badh2-R2可以快速开展香味基因的MAS育种。本研究结果将有助于利用Badh2基因位点的分子标记培育香型优质水稻品种,为改良贵州省水稻品种的香味品质提供了技术支撑。